Métodos y sistemas para el análisis de células individuales.

Un método para el análisis de la biopsia de un tumor heterogéneo procedente de un sujeto humano,

que comprende:

i. particionar aleatoriamente las células de la biopsia en ubicaciones individuales, en las que las células son clasificadas antes de su partición de acuerdo con la presencia de uno o más marcadores en la superficie de la célula;

ii. recoger las células particionadas individualmente a partir de las ubicaciones individuales mediante el uso de un dispositivo automatizado;

iii. llevar a cabo un análisis del transcriptoma de al menos 50 genes de las células particionadas individualmente, en el que el análisis del transcriptoma se utiliza para categorizar las células aisladas en grupos que muestran similitudes en su perfil de expresión; y

iv. usar los datos del transcriptoma para la identificación de uno o más objetivos terapéuticos para el tratamiento de dicho tumor heterogéneo, en el que los perfiles de expresión obtenidos se comparan con un perfil de referencia o de control para la elaboración de un diagnóstico, de un pronóstico o de un análisis de la eficacia farmacológica, en el que el uno o más objetivos terapéuticos son una metiltransferasa de ADN, una metiltransferasa de ARN, una enzima similar a una metiltransferasa, una metiltransferasa de lisina de histona, una metiltransferasa de arginina de histona, una desmetilasa de histona, una cinasa de proteína.

Métodos y sistemas para el análisis de células individuales Reivindicación de prioridad Antecedentes de la invención

En los años recientes, el análisis de los patrones de expresión génica proporciona una forma de mejorar el diagnóstico y la estratificación del riesgo de muchas enfermedades. Por ejemplo, un análisis no supervisado de los patrones de expresión génica globales ha identificado distintos subtipos de cáncer, que se distinguen por unas grandes diferencias en la expresión génica, enfermedades que eran consideradas homogéneas si nos basábamos en los métodos diagnósticos clásicos. Dichos subtipos moleculares están a menudo asociados con diferentes resultados clínicos. El patrón de expresión génica global también puede ser examinado para evaluar las características que se correlacionan con el comportamiento clínico, para la creación de unas firmas pronosticas.

El cáncer, como muchas enfermedades, no es frecuentemente el resultado de una única causa bien definida, sino que más bien puede contemplarse como muchas enfermedades, provocadas cada una de ellas por diferentes aberraciones en rutas de información, que finalmente dan como resultado unos fenotipos patológicos aparentemente similares. La identificación de los polinucleótidos que son expresados diferencialmente en las células cancerosas, precancerosas o con un bajo potencial metastásico con respecto a las células normales del mismo tipo tisular, puede proporcionar una base para herramientas diagnósticas, facilitando el descubrimiento de fármacos al proporcionar objetivos para agentes candidatos, y adicionalmente sirve para identificar agentes terapéuticos para terapias oncológicas que están más adaptados al tiempo de cáncer que se va a tratar.

La identificación de los productos génicos expresados diferencialmente también ayuda adicionalmente a la comprensión de la progresión y la naturaleza de enfermedades complejas, y es la clave para la identificación de los factores genéticos que son responsables de los fenotipos relacionados con el desarrollo de, por ejemplo, los genotipos metastásicos o inflamatorios. La identificación de los productos génicos que son expresados diferencialmente en diversas etapas y en diversos tipos de células, puede proporcionar, ambos, unas pruebas diagnósticas tempranas y servir adicionalmente como agentes terapéuticos. Adicionalmente, el producto de un gen expresado diferencialmente puede ser la base de ensayos de cribado para la identificación de agentes quimioterapéuticos que modulen su actividad (por ejemplo, su expresión, su actividad biológica, y similares).

El diagnóstico temprano de una enfermedad tiene una importancia crucial para detener la progresión de la enfermedad y reducir la morbilidad. El análisis de muestras de un paciente para la identificación de los patrones de expresión génica proporciona la base de una terapia específica más racional de la enfermedad que pueda dar como resultado una disminución en los efectos secundarios adversos con respecto a las terapias convencionales. Adicionalmente, la confirmación de que una lesión presenta menos riesgo para el paciente (por ejemplo, que un tumor es benigno) puede evitar terapias innecesarias. En resumen, la identificación de los patrones de expresión génica en células relacionadas con enfermedades puede proporcionar una base terapéutica, diagnóstica, pronostica, teramétrica, y similares.

Como otro ejemplo, las enfermedades infecciosas provocan daños en tejidos y órganos que dan lugar a la morbilidad y la mortalidad de un organismo en particular. En el caso de las infecciones por gripe A, la causa más frecuente de hospitalización y muerte es la infección del tejido pulmonar. Sin embargo, las células precisas que son infectadas por la gripe y las células que reparan los pulmones lesionados no son comprendidas a nivel de la célula individual. Dicho conocimiento podría ayudar a identificar objetivos terapéuticos para una intervención, tales como nuevos fármacos para prevenir infecciones víricas, y nuevos tratamientos para mejorar la morbilidad.

Muchos tumores contienen poblaciones mixtas de células cancerosas que podrían diferir con respecto a las rutas de señalización que usan para su crecimiento y supervivencia. Dado que estas células cancerosas difieren con respecto a su respuesta a una terapia en particular, la resistencia de una población de células madre cancerosas en particular contribuye a las recaídas después de una radioterapia y una quimioterapia citotóxicas. Como tales, los fracasos de tratamiento en clínica pueden ser debidos parcialmente a la resistencia de una población de células cancerosas en particular a la terapia

El encogimiento inicial observado a menudo en un tumor poco después del tratamiento puede reflejar más que la relativa sensibilidad de una subpoblación de células cancerosas, que podría comprender el conjunto de un tumor y puede no ser importante para la supervivencia a largo plazo. Por lo tanto, la variable clínica más importante para la evaluación de la respuesta al tratamiento y el pronóstico puede no ser el tamaño absoluto del tumor sino más bien el número absoluto de una población de células cancerosas en particular que quedan después del tratamiento. Si se pudieran identificar las diferencias en las rutas de señalización usadas por estas diferentes poblaciones de células cancerosas en un tumor, entonces podrían diseñarse terapias que se dirijan a cada población de células. Mediante el direccionamiento a todas las poblaciones, se podrían eliminar tumores mediante el tratamiento con fármacos que afecten a cada población diferente.

Como otro ejemplo, la enfermedad inflamatoria del intestino da como resultado la desestabilización de la estructura

normal del Intestino, dando como resultado problemas tales como diarrea, hemorragias y malabsorclón. Estos problemas están provocados por la destrucción del revestimiento normal de la mucosa del Intestino. El revestimiento de la mucosa del colon consiste en criptas, en las que las células caliciformes, las células madre y las células progenitoras están en la base de la cripta, mientras que las células maduras, que Incluyen los enterocltos y las células caliciformes, residen en la parte superior de la cripta. Con respecto a la enfermedad Inflamatoria del Intestino, no se sabe qué poblaciones celulares están lesionadas ni qué rutas de señalización son necesarias para la reparación de la mucosa dañada.

Los métodos para la determinación precisa del número y el fenotipo de las células en lesiones patológicas mediante el uso de unas pocas células es de gran interés para el pronóstico, el diagnóstico, la identificación de las rutas a las que pueden dirigirse productos terapéuticos específicos, de múltiples enfermedades, incluyendo la enfermedad Inflamatoria del Intestino, infecciones, cánceres, enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatolde, e Infecciones. La presente invención aborda este asunto.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para el uso de la caracterización de la expresión génlca de células Individuales y/o el análisis del transcriptoma. Un método proporcionado en el presente documento es un método para la identificación de diferentes poblaciones celulares en una muestra de un tumor sólido heterogéneo, que comprende: particionar aleatoriamente las células individuales del tumor en ubicaciones individuales; llevar a cabo el análisis del transcriptoma de una pluralidad de los genes de las células particionadas individualmente en las ubicaciones individuales; y llevar a cabo un análisis agrupado para la identificación de una o más poblaciones celulares diferentes. En algunos casos, las células individuales no son enriquecidas antes de particionar. El análisis del transcriptoma puede llevarse a cabo sobre al menos 1.000 células individuales simultáneamente. El análisis del transcriptoma puede llevarse a cabo mediante el uso de un análisis de los ácidos nucleicos. Las ubicaciones individuales pueden estar en un sustrato plano. En algunas formas de realización, el particionado aleatorio se lleva a cabo en un sistema microfluido. El análisis del transcriptoma puede comprender el análisis dell ARN expresado, del ARN no expresado o de ambos. El análisis del transcriptoma puede ser un análisis completo del transcriptoma. El análisis del transcriptoma puede comprender la amplificación del ARN mediante el uso de un único conjunto de pares de cebadores, que en algunas formas de realización no son cebadores internos.

El análisis del transcriptoma puede llevarse a cabo simultáneamente o sustancialmente en tiempo real en todas las células individuales o un en subconjunto. La una... [Seguir leyendo]

1. Un método para el análisis de la biopsia de un tumor heterogéneo procedente de un sujeto humano, que comprende:

1. particionar aleatoriamente las células de la biopsia en ubicaciones individuales, en las que las células son clasificadas antes de su partición de acuerdo con la presencia de uno o más marcadores en la superficie de la célula;

ii. recoger las células particionadas individualmente a partir de las ubicaciones individuales mediante el uso de un dispositivo automatizado;

iii. llevar a cabo un análisis del transcriptoma de al menos 50 genes de las células particionadas individualmente, en el que el análisis del transcriptoma se utiliza para categorizar las células aisladas en grupos que muestran similitudes en su perfil de expresión; y

iv. usar los datos del transcriptoma para la identificación de uno o más objetivos terapéuticos para el tratamiento de dicho tumor heterogéneo, en el que los perfiles de expresión obtenidos se comparan con un perfil de referencia o de control para la elaboración de un diagnóstico, de un pronóstico o de un análisis de la eficacia farmacológica,

en el que el uno o más objetivos terapéuticos son una metiltransferasa de ADN, una metiltransferasa de ARN, una enzima similar a una metiltransferasa, una metiltransferasa de lisina de histona, una metiltransferasa de arginina de histona, una desmetilasa de histona, una cinasa de proteína.

2. El método de la reivindicación 1, en el que uno o más de los objetivos terapéuticos es BRD7.

3. El método de la reivindicación 1, en el que uno o más de los objetivos terapéuticos es BMI1.

4. El método de la reivindicación 1, en el que uno o más de los objetivos terapéuticos es TRIM 24.

5. Un método para el análisis de la biopsia de un tumor heterogéneo procedente de un sujeto humano, que

comprende:

i. particionar aleatoriamente las células de la biopsia en ubicaciones individuales, en las que las células son clasificadas antes de su partición de acuerdo con la presencia de uno o más marcadores en la superficie de la célula;

ii. recoger las células particionadas individualmente a partir de las ubicaciones individuales mediante el uso de un dispositivo automatizado;

iii. llevar a cabo un análisis del transcriptoma de al menos 50 genes de las células particionadas individualmente, en el que el análisis del transcriptoma se utiliza para categorizar las células aisladas en grupos que muestran similitudes en su perfil de expresión; y

iv. usar los datos del transcriptoma para la identificación de uno o más marcadores diagnósticos presentes en la biopsia tumoral para la detección del cáncer y la evaluación del estadio del cáncer, en el que los perfiles de expresión obtenidos se comparan con un perfil de referencia o de control para la elaboración de un diagnóstico, de un pronóstico o de un análisis de la eficacia farmacológica,

en el que el uno o más marcadores diagnósticos son una metiltransferasa de ADN, una metiltransferasa de ARN, una enzima similar a una metiltransferasa, una metiltransferasa de lisina de histona, una metiltransferasa de arginina de histona, una desmetilasa de histona, una cinasa de proteína.

6. Un método para el análisis de la biopsia de un tumor heterogéneo procedente de un sujeto humano, que comprende:

i. particionar aleatoriamente las células de la biopsia en ubicaciones individuales, en las que las células son clasificadas antes de su partición de acuerdo con la presencia de uno o más marcadores en la superficie de la célula;

ii. recoger las células particionadas individualmente a partir de las ubicaciones individuales mediante el uso de un dispositivo automatizado;

iii. llevar a cabo un análisis del transcriptoma de al menos 50 genes de las células particionadas individualmente, en el que el análisis del transcriptoma se utiliza para categorizar las células aisladas en grupos que muestran similitudes en su perfil de expresión; y

iv. usar los datos del transcriptoma para la identificación de uno o más marcadores diagnósticos para la evaluación de la eficacia del tratamiento de dicho tumor heterogéneo, en el que los perfiles de expresión obtenidos se comparan con un perfil de referencia o de control para la elaboración de un diagnóstico, de un pronóstico o de un análisis de la

eficacia farmacológica,

en el que el uno o más marcadores diagnósticos son una metiltransferasa de ADN, una metiltransferasa de ARN, una enzima similar a una metiltransferasa, una metiltransferasa de lisina de histona, una metiltransferasa de arginina de histona, una desmetilasa de histona, una cinasa de proteína.

5 7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que uno o más de los marcadores diagnósticos es BRD7.

8. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que uno o más de los marcadores diagnósticos es BMI1.

9. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que uno o más de los marcadores diagnósticos es TRIM 24.