Métodos y composiciones para la inhibición mediada por iARN de la expresión génica en mamíferos.

Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento que comprende administrar la composición a un mamífero adulto para reducir la expresión de una secuencia diana en el hígado de dicho mamífero adulto,

comprendiendo la composición un vehículo farmacéuticamente aceptable y:

un agente de iARN seleccionado de un ARNip o un ARNhp, en el que dichos ARNip o ARNhp son específicos para una secuencia diana presente en una célula hepática de dicho mamífero adulto y reducen la expresión de la secuencia diana y en donde el ARNip o el ARNhp tienen una longitud de entre 15 y 30 nucleótidos o tienen una estructura dúplex de 15 a 29 pares de bases de longitud; o

un vector que comprende ADN que se transcribe in vivo en dichos ARNhp o ARNip.

Métodos y composiciones para la inhibición mediada por iARN de la expresión génica en mamíferos

Introducción

Campo de la invención

El campo de la presente invención es la iARN.

Antecedentes de la invención

El ARN bicatenario induce el silenciamiento génico fuerte y específico mediante un proceso denominado interferencia por ARN (iARN) o silenciamiento génico postranscripcional (SGPT). La iARN está mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (CSIA), una nucleasa multicomponente específica de secuencia que destruye mensajeros de ARN homólogos al desencadenador del silenciamiento. Se sabe que el CSIA contiene ARN cortos (aproximadamente 22 nucleótidos) derivados del desencadenador de ARN bicatenario.

La iARN se ha convertido en el método de elección para las investigaciones de pérdida de función en numerosos sistemas que incluyen C. elegans, Drosophila, hongos, plantas, e incluso de líneas celulares de mamífero. Para silenciar específicamente un gen en la mayoría de las líneas celulares de mamífero, se usan ARN interferentes pequeños (ARNip) debido a que los ARNbc grandes (>30 pb) desencadenan la respuesta de interferón y producen silenciamiento génico no específico.

Hasta la fecha, los solicitantes no conocían ningún informe de aplicación satisfactoria de tecnología de iARN a organismos de mamífero no embrionarios. La demostración de que la iARN funciona en organismos de mamífero no embrionarios proporcionaría varias aplicaciones adicionales importantes para la tecnología de iARN, que incluyen tanto investigación como aplicaciones terapéuticas, y es, por tanto, de intenso interés.

Bibliografía relevante

Documento WO 01/68836. Véanse también: Bernstein et al., RNA (2001) 7: 1509-1521; Bernstein et al., Nature (2001) 409:363-366; Billy et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (2001) 98:14428-33; Caplan et al., Proc. Nati Acad. Sci USA (2001) 98:9742-7; Carthewet al., Curr. Opin. Cell Biol (2001) 13: 244-8; Elbashiret al., Nature (2001) 411: 494- 498; Hammond et al., Science (2001) 293:1146-50; Hammond et al., Nat. Ref. Genet. (2001) 2:110-119; Hammond et al., Nature (2000) 404:293-296; McCaffrrey et al., Nature (2002): 418-38-39; y McCaffrey et al., Mol. Ther. (2002) 5:676-684; Paddison et al., Genes Dev. (2002) 16:948-958; Paddison et al., Proc. Nati Acad. Sci USA (2002) 99:1443-48; Sui et al., Proc. Nati Acad. Sci USA (2002) 99:5515-20. Las patentes de EE.UU. de interés incluyen 5.985.847 y 5.922.687. También de interés es el documento WO/11092. Referencias de interés adicionales incluyen: Acsadi et al., New Biol. (Jan. 1991) 3:71-81; Chang et al., J. Virol. (2001) 75:3469-3473; Hickman et al., Hum. Gen. Ther. (1994) 5:1477-1483; Liu et al., Gene Ther. (1999) 6:1258-1266; Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-1468; y Zhang et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1735-1737: y Zhang et al., Gene Ther. (1999) 7:1344-1349.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento que comprende administrar la composición a un mamífero adulto para reducir la expresión de una secuencia diana en el hígado de dicho mamífero adulto, comprendiendo la composición un vehículo farmacéuticamente aceptable y:

un agente de iARN seleccionado de un ARNip o un ARNhp, en el que dicho ARNip o ARNhp es específico para una secuencia diana presente en una célula hepática de dicho mamífero adulto y reduce la expresión de la secuencia diana y en el que el ARNip o ARNhp tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud o tiene una estructura de dúplex de 15 a 29 pares de bases de longitud; o un vector que comprende ADN que se transcribe in vivo en dicho ARNhp o ARNip.

La administración puede ser mediante un protocolo de administración hidrodinámica.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 proporciona construcciones de expresión empleadas en los experimentos de iARN descritos a continuación.

Figuras 2A a 2D: interferencia por ARN en ratones adultos. Figura 2A) Imágenes representativas de luz emitida de ratones co-transfectados con el plásmido de luciferasa pGL3-control y tanto sin ARNip (izquierda), ARNip de luciferasa (centro) como ARNip sin relacionar (derecha). Una imagen en pseudocolor que representa la intensidad de luz emitida (rojo principalmente y azul menos intenso) superpuesta en una imagen de referencia de escala de grises (para orientación) muestra que el iARN funciona en adultos mamíferos. Cuarenta pg de

ARNip 21-meros hibridados (Dharmacon) se co-inyectaron en los hígados de ratones con los 2 pg de pGL3- ADN de control y 800 unidades de RNasin (Promega) en 1,8 mi de PBS en 5-7 segundos. Setenta y dos horas después de la inyección original, los ratones se anestesiaron y se les administró 3 mg de luciferina intraperitonealmente 15 min antes de la obtención de imágenes. Figura 2B) Resumen de datos de ARNip. Los ratones que recibieron ARNip de luciferasa emitieron significativamente menos luz que los controles no tratados. Se realizó un análisis unilateral de ANOVA con una prueba de Fisher a posteriori. Los grupos de ARNip sin tratar y sin relacionar fueron estadísticamente similares. Figura 2C) pShh1-Ff1 (centro) pero no pShh1-Ff1rev (derecha) redujo la expresión de luciferasa en ratones en comparación con el control no tratado (izquierda). Se co-inyectaron 10 pg de pShh1-Ff1 o pShh1-rev con 40 pg de pLuc-NS5B en 1,8 mi de PBS. Figura 2D) Cuantificación de datos de pShhl. Los animales se trataron según las Pautas de la NIH para el Cuidado de Animales y las Pautas de la Universidad de Stanford.

La Figura 3 proporciona una representación esquemática de las construcciones empleadas en un ensayo de inhibición del VHC antisentido con morfolino fosforamidato realizado en la Sección experimental, más adelante. La Figura 4 proporciona información de fondo del mecanismo de inhibidores antisentido.

Las Figuras 5A a 5F proporcionan resultados gráficos de un ensayo de inhibición del VHC antisentido con morfolino fosforamidato.

Definiciones

Por comodidad, aquí se recogen ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico con el que se ha asociado. Un tipo de vector es un vector integrado genómico, o "vector integrado", que puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped. Otro tipo de vector es un vector episómico, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosómica en un huésped apropiado, por ejemplo, una célula huésped eucariota o procariota. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente asociados se denominan en el presente documento `Vectores de expresión". En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente, a menos que sea de otro modo evidente del contexto.

Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando corresponda, ácido ribonucleico (ARN). También debe entenderse que el término incluye, según sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" o "gen recombinante" se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la presente invención, que incluye tanto secuencias de exones como (opcionalmente) de intrones. Un "gen recombinante" se refiere a ácido nucleico que codifica tales polipéptidos reguladores, que opcionalmente pueden incluir secuencias de intrones que se derivan de ADN cromosómico. El término "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado que no se traduce en proteína y generalmente se encuentra entre exones. Como se usa en el presente documento, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, en una célula receptora por transferencia génica mediada por ácido nucleico.

Una "secuencia codificante de proteína" o una secuencia que "codifica" un polipéptido o péptido particular es una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento que comprende administrar la composición a un mamífero adulto para reducir la expresión de una secuencia diana en el hígado de dicho mamífero adulto, comprendiendo la composición un vehículo farmacéuticamente aceptable y:

un agente de iARN seleccionado de un ARNip o un ARNhp, en el que dichos ARNip o ARNhp son específicos para una secuencia diana presente en una célula hepática de dicho mamífero adulto y reducen la expresión de la secuencia diana y en donde el ARNip o el ARNhp tienen una longitud de entre 15 y 30 nucleótidos o tienen una estructura dúplex de 15 a 29 pares de bases de longitud; o un vector que comprende ADN que se transcribe in vivo en dichos ARNhp o ARNip.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente de iARN es un vector que comprende ADN que se transcribe in vivo en dichos ARNip o ARNhp.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente de iARN es un ARNip o un ARNhp.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de infección viral en el hígado de dicho mamífero adulto en donde la secuencia diana está presente en el hígado después de la infección viral del mismo.

5. La composición para su uso según la reivindicación 4, en donde la infección viral es una infección viral por ARN.

6. La composición para su uso según la reivindicación 4, en donde la infección viral es una infección viral por hepatitis.

7. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente de iARN es para administración a dicho mamífero adulto conjuntamente con un inhibidor de ARNasa.

8. La composición para su uso de la reivindicación 4, en donde la secuencia diana presente en la célula hepática en dicho mamífero adulto después de infección viral del mismo es una secuencia de ARN viral genómica.

9. La composición para su uso de la reivindicación 4, en donde la secuencia diana presente en la célula hepática en el mamífero adulto después de la infección del mismo es un transcrito codificado por un virus de ARN.

10. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde la secuencia del gen diana es endógena.