Métodos para identificar los hábitats de insectos.

Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica,

que comprende las etapas de:

(a) determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats;

(b) alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a);

(c) eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos;

(d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios discriminadores de tipos;

(e) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y

(f) determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad de la NADH deshidrogenasa (NDS),

y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium castaneum:

(1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o

un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A;

(2) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(3) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A;

(4) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(5) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(6) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o

un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G;

(7) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o

un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C;

y donde dicho sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica:

(8) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.

Métodos para identificar los hábitats de insectos

Campo técnico La presente invención se refiere a métodos para preparar un criterio para identificar el hábitat de insectos del mismo tipo mediante el análisis del ADN.

Antecedente de la técnica Japón es el mayor importador mundial de alimentos. Estos alimentos incluyen no solo productos alimenticios sino también materiales de productos alimenticios tales como tales como soja y granos comestibles tales como maíz. Estos se transportan por el aire o el mar desde países exportadores a Japón y por tierra en países exportadores.

Los alimentos importados se pueden infestar con gusanos durante su almacenamiento en un almacén. Puede estar originado por contaminación con insectos que habitan en el almacén o el país exportador o la ruta de transporte, y es muy importante seguir la ruta de contaminación de los insectos para adoptar medidas de seguridad. Sin embargo, algunos insectos se distribuyen en varias zonas del mundo, y en aquellos casos donde los insectos de la misma morfología habitan diversas zonas, ha sido difícil determinar a partir de sus características morfológicas el lugar donde los insectos han contaminado el alimento, es decir, el hábitat de los insectos, y ha sido también difícil localizar la causa de la contaminación con los insectos.

Descripción de la invención

Problemas que va a resolver la invención La presente invención proporciona métodos para preparar un criterio para identificar el hábitat de los insectos del mismo tipo mediante el análisis del ADN.

Cuando el alimento has sido contaminado por Tribolium castaneum durante su almacenamiento en un almacén portuario, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, aún no existen medios para identificar si se ha contaminado con el insecto en el almacén portuario, estando ya en Japón o si se ha contaminado en el país exportador o en la ruta de transporte, donde habita el insecto, y sería muy deseable desarrollar una técnica para identificar el lugar donde el alimento se ha contaminado con plagas de insectos.

Medios para resolver los problemas Los inventores han consagrado sus estudios a resolver los anteriores problemas. Los inventores han analizado las secuencias de nucleótidos del gen COI mitocondrial y del gen NDS de Tribolium castaneum de diversas zonas de Japón y en el extranjero para encontrar que existe un polimorfismo específico de hábitat en cada secuencia de nucleótidos y conseguir la presente invención.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona las siguientes realizaciones que se caracterizan en los 45 elementos (1) a (10) :

1. Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende las etapas de:

(a) determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats;

(b) alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a) ;

(c) eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos;

(d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios 55 discriminadores de tipos;

(e) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y

(f) determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad S de la NADH deshidrogenasa (NDS) , y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium castaneum:

(1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo S' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido

253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A;

(2) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(3) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A;

(4) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(5) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(6) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G;

(7) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C; y donde el sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica:

(8) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.

2. El método de acuerdo con el punto 1, que comprende además las siguientes etapas además de las etapas que se han definido en el punto 1:

(g) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos en la etapa (f) que se define en el punto 1 para extraer uno o más nucleótidos existentes en un solo tipo pero no en otros tipos; y

(h) definir el uno o más nucleótidos extraídos en dicha etapa (g) solos o en combinación, como un criterio discriminador de zona.

3. Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende determinar el polimorfismo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el método del punto 1, comparar la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos obtenido mediante el método del punto 1 o 2 y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos para identificar el hábitat de Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica, que comprende las etapas de: 5

(a) determinar las secuencias de nucleótidos del ADN de uno o más insectos de dos o más hábitats;

(b) alinear las secuencias de nucleótidos determinadas en dicha etapa (a) ;

(c) eliminar sitios que consisten en uno o más nucleótidos conservados en todas las secuencias de nucleótidos alineadas en dicha etapa (b) a partir de las secuencias de nucleótidos;

(d) definir todos o parte de los sitios que permanecen tras la eliminación en dicha etapa (c) como sitios discriminadores de tipos;

(e) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los sitios discriminadores de tipos obtenidos en dicha etapa (d) para clasificar sitios que discriminan tipos completamente idénticos como el mismo tipo y sitios que discriminan tipos incompletamente idénticos como uno o más tipos diferentes; y

(f) determinar el hábitat de cada tipo clasificado en dicha etapa (e) sobre la base de los hábitats de insectos que pertenecen a cada tipo, definiendo por tanto el sitio discriminador de tipo de cada tipo como un criterio, donde el ADN es el gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa mitocondrial (COI) y/o el gen de la subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa (NDS) , y donde dicho sitio discriminador de tipo es al menos uno del siguiente grupo para el hábitat de Tribolium

castaneum:

(1) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A;

(2) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2 es G, y el nucleótido 331º es G, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(3) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 3 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 359º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 10 es A, y el nucleótido 419º es A;

(4) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 121º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4 es A, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(5) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 370º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 5 es C, y/o un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 248º contado 45 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9 es G, y el nucleótido 308º es A;

(6) un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 22º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 6 es T, el nucleótido 142º es G, y el nucleótido 317º es C, y/o 50 un sitio discriminador de tipo caracterizado por uno o más de los siguientes: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 11 es T, el nucleótido 248º es G, el nucleótido 308º es C, el nucleótido 359º es G y el nucleótido 419º es G;

(7) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 317º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 7 es T, y/o 55 un sitio discriminador de tipo caracterizado por lo siguiente: el nucleótido 200º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 12 es C;

y donde dicho sitio discriminador de tipo es el siguiente para el hábitat de Rhyzopertha dominica:

(8) un sitio discriminador de tipo caracterizado por los siguientes: el nucleótido 160º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 34 es T.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además las siguientes etapas además de las etapas que se han definido en la reivindicación 1: 65

(g) comparar nucleótidos que se corresponden entre sí en los criterios obtenidos en la etapa (f) que se define en la reivindicación 1 para extraer uno o más nucleótidos existentes en un solo tipo pero no en otros tipos; y

(h) definir el uno o más nucleótidos extraídos en dicha etapa (g) solos o en combinación, como un criterio

discriminador de zona. 5

3. Un método para identificar el hábitat un insecto muestra, que comprende determinar el polimorfismo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el método de la reivindicación 1, comparando la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene un criterio basado en polimorfismos de nucleótidos únicos obtenidos mediante el método de la reivindicación 1 o 2 y una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una zona que tiene el criterio de una secuencia de nucleótidos obtenida del insecto muestra, y analizar si un nucleótido del sitio correspondiente al criterio de la secuencia de nucleótidos de la muestra es idéntico o no al nucleótido del criterio, identificando por tanto el hábitat de la muestra, donde dicho insecto muestra es Tribolium castaneum o Rhyzopertha dominica.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el método comprende las etapas de: almacenar una tabla de criterios que contiene datos que representan la secuencia de nucleótidos de un criterio obtenido mediante el método de la reivindicación 1 o 2 y datos que representan la localización del nucleótido en la secuencia de nucleótidos en un ordenador en el cual se ejecuta un programa informático de análisis, almacenar una lista de secuencias de nucleótidos de muestra que contiene datos que representan un nucleótido obtenido del insecto muestra, y permitir al ordenador comparar los datos que representan nucleótidos de las localizaciones correspondientes en las secuencias de nucleótidos entre la lista de secuencias de nucleótidos de muestra y la tabla de criterios con referencia a los datos que representan la localización en la secuencia de nucleótidos de la tabla de criterios.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal

isla de Japón o no, donde se satisfacen uno o más de los siguientes criterios: el nucleótido 229º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen COI de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 1 es G, el nucleótido 253º es T, y el nucleótido 298º es G, y/o el nucleótido 248º contado desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos derivada del gen ND5 de Tribolium castaneum que se muestra en la SEC ID Nº: 8 es A.

6. Un cebador o sonda que comprende al menos uno de los nucleótidos que constituyen un criterio preparado mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho cebador o sonda comprende un ácido nucleico que se muestra en las SEC ID Nos: 17-29.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan el cebador y/o la sonda de la reivindicación 6, comprendiendo el método las etapas de:

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

(b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y/o la sonda de la reivindicación 6;

(c) amplificar un fragmento de ADN; y

(d) identificar el hábitat del insecto muestra.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan el cebador y la sonda de la reivindicación 6,

comprendiendo el método las etapas de: 45

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

(b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador y la sonda de la reivindicación 6;

(c) amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(d) detectar una sustancia fluorescente con la cual se ha marcado la sonda por adelantado; y

(e) identificar el hábitat del insecto muestra.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el cebador de la reivindicación 6 se usa para identificar si el hábitat de Tribolium castaneum es la principal isla de Japón o no, comprendiendo el método las etapas de:

(a) extraer el ADN de una muestra de Tribolium castaneum;

(b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador de la reivindicación 6;

(c) amplificar un fragmento de ADN; y

(d) identificar si la muestra de Tribolium castaneum es el Tribolium castaneum que habita la principal isla de Japón o el Tribolium castaneum que habita otras zonas.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde se usan la sonda de la reivindicación 6 y una pareja de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores, comprendiendo el método las etapas de:

(a) extraer el ADN de un insecto muestra;

(b) poner en contacto el ADN extraído en dicha etapa (a) con el cebador de la reivindicación 6 y un par de cebadores que pueden amplificar la sonda flanqueada por los anteriores;

(c) amplificar un fragmento de ADN usando la PCR en tiempo real;

(d) detectar una sustancia fluorescente con la cual se ha marcado la sonda por adelantado; y

(e) identificar el hábitat del insecto muestra.