Métodos para generar preparados exentos de helper de alto título de vectores de AAV recombinantes liberados.

Un método para generar una población de partículas de virus, que comprende la etapa de:

a) incubar una célula productora en un medio de cultivo celular y monitorizar y ajustar al menos una condición para fomentar la liberación de partículas de virus de la célula, con lo que las partículas de virus son liberadas de la célula productora al medio de cultivo sin lisar las células, en el que la condición que fomenta la liberación de partículas de virus comprende una o más condiciones seleccionadas de pH, osmolalidad y temperatura, y

b) recolectar las partículas virales del medio de cultivo celular sin lisar las células, obteniendo con ello una población de partículas virales; en donde el virus es virus adeno-asociado (AAV).

Métodos para generar preparados exentos de helper de alto título de vectores de AAV recombinantes liberados

DECLARACIÓN DE DERECHOS PARA INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN PATROCINADA FEDERALMENTE

Esta invención se realizó en parte durante el trabajo con el apoyo de una subvención del Instituto Nacional de la Salud (NIH - National Institute of Health) R44DK4460. El Gobierno puede tener ciertos derechos en esta invención.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere en general al campo de vectores de virus adeno-asociados (AAV) recombinantes y de preparados adeno-asociados de los mismos que pueden ser utilizados para la transferencia génica. Más específicamente, se refiere a métodos para generar preparados con alto título de vectores de AAV recombinantes que están sustancialmente exentos de virus helper (p. ej., adenovirus) así como proteínas celulares por la liberación de partículas virales a partir de células productoras sin lisis celular.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los virus adeno-asociados (AAV) tienen características únicas que los hacen atractivos como vectores para la terapia génica. Los virus adeno-asociado infectan a una amplia gama de tipos de células. Sin embargo, son no- transformadores y no están implicados en la etiología de enfermedad humana alguna. La introducción de ADN a células huésped del receptor conduce generalmente a la persistencia y expresión del ADN a largo plazo sin perturbar el metabolismo normal de la célula.

Existen al menos tres características deseables de un preparado de un vector de AAV recombinante para su uso en la transferencia de genes, especialmente en la terapia génica humana. En primer lugar, se prefiere que el vector deba ser generado en títulos suficientemente elevados para transducir una proporción eficaz de células en el tejido diana. La terapia génica in vivo requiere típicamente un número elevado de partículas de vector. Por ejemplo, algunos tratamientos pueden requerir más de 108 partículas, y el tratamiento de la fibrosis quística por entrega directa a las vías aéreas puede requerir más de 101° partículas. En segundo lugar, se prefiere que los preparados de vector deben estar esencialmente exentos de AAV competente para la replicación (es decir, fenotípicamente AAV de tipo salvaje que puede ser replicado en la presencia virus helper o de funciones de virus helper). En tercer lugar, se prefiere que el preparado de vector de rAAV como un todo esté esencialmente libre de otros virus (tales como un virus helper utilizado en la producción de AAV), así como virus helper y proteínas celulares y otros componentes tales como lípidos e hidratos de carbono, con el fin de minimizar o eliminar cualquier riesgo de generar una respuesta inmune en el contexto de la terapia génica. Este último punto es especialmente importante en el contexto del AAV, ya que el AAV es un virus "helper-dependiente" que requiere la co-infección con un virus helper (típicamente adenovirus) u otro suministro de funciones de virus helper con el fin de ser replicado y empaquetado eficazmente durante el proceso de producción de AAV; y, además de ello, se ha observado que adenovirus generan una respuesta inmune del huésped en el contexto de aplicaciones de terapia génica (véase, p. ej., Byrnes et al, Neuroscience 66:1015, 1995; McCoy et al, Human Gene Therapy 6:1553, 1995; y Barr et al, Gene Therapy 2:151,1995). Los métodos de la presente invención abordan estas y otras características deseables de preparados de vector rAAV, según se describe e ilustra en detalle más adelante.

Comentarios generales de virología AAV y genética están disponibles en otros documentos. El lector puede referirse, entre otros, a Cárter, "Handbook of Parvoviruses", vol. I, págs. 169-228 (1989), y Berns, "Virology", págs. 1743-1764, Raven Press, (1990). AAV es un virus defectuoso en la replicación, lo que significa que se basa en un virus helper con el fin de completar su ciclo de replicación y empaquetamiento en una célula huésped. Virus helper capaces de apoyar la replicación de AAV están ejemplificados por adenovirus, pero incluyen otros virus tales como herpes y virus de la viruela. El genoma de AAV comprende generalmente los genes de empaquetamiento rep y cap, proporcionándose otras funciones necesarias en trans a partir del virus helper y la célula huésped.

A modo de ilustración, el genoma lineal de serotipo AAV2 termina en cada extremo por una secuencia de repetición terminal invertida (ITR). Entre las ITRs hay tres promotores de la transcripción p5, p19 y p40, que se utilizan para expresar los genes rep y cap (Laughlin et al., 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:5567-5571). Las secuencias ITR son requeridas en cis y son suficientes para proporcionar un origen funcional de la replicación, una integración en el genoma de la célula y una escisión y rescate eficaces de los cromosomas de la célula huésped o plásmidos

recombinantes. Los productos de los genes rep y cap proporcionan funciones para la replicación y encapsidación del genoma viral, respectivamente, y es suficiente con que estén presentes en trans.

Genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos por procesos tales como formación de colas en CG (Samulski et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081), la adición de enlazadores sintéticos que contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción (Laughlin et al, 1983, Gene, 23:65-73) o por ligamiento directo de extremos romos (Senapathy y Cárter, 1984, J Biol. Chem., 259:4661-4666). La transfección de estos plásmidos recombinantes de AAV en células de mamífero con un virus helper apropiado resulta en el rescate y la escisión del genoma de AAV libre de cualquier secuencia de plásmido, la replicación del genoma rescatado y la generación de la progenie de partículas de AAV infecciosas.

Vectores de AAV recombinantes que comprenden un polinucleótido heterólogo de interés terapéutico se pueden construir mediante la sustitución de partes de la secuencia de codificación de AAV en plásmidos bacterianos con el polinucleótido heterólogo. Principios generales de la construcción del vector de rAAV también se revisan en otros documentos. Véase, p. ej., Cárter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129). Las ITRs de AAV son generalmente retenidas, ya que el empaquetamiento del vector requiere que estén presentes en c/'s. Sin embargo, se pueden omitir otros elementos del genoma de AAV, en particular uno o más de los genes de empaquetamiento. El plásmido vector puede ser empaquetado en una partícula de AAV mediante el suministro de los genes de empaquetamiento omitidos en trans a través de una fuente alternativa. Un cierto número de publicaciones describen diversos enfoques para la producción de vectores de rAAV. Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al, J. Virol, 62:1963 (1988); Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al, J. Virol, 63:3822-3828 (1989); Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349 (1992); patente de EE.UU. 5.173.414; documento WO 95/13365 (Targeted Genetics Corporation y Johns Hopkins University) y la correspondiente patente de EE.UU. n° 5.658.776 (por Flotte et al.); documento WO 95/13392 (Trempe et al.); documento WO 96/17947 (por Targeted Genetics Corporation, J. Alien).

Ya que son particularmente útiles altos títulos de preparados de vector de rAAV, pero la producción de altos títulos de rAAV, en particular en los procesos a gran escala, puede conducir a la generación de cantidades significativas de virus helper contaminantes (p. ej., adenovirus o "Ad"), proteínas de virus helper (p. ej., proteínas "Ad"), y/o proteínas celulares, se hizo especialmente importante diseñar métodos expansibles para la producción de rAAV que se pueden utilizar para la generación de preparados de alto título que están sustancialmente exentos de virus contaminantes y/o proteínas virales o celulares.

Se han descrito métodos para generar preparados de alto título de vectores de AAV recombinantes. La solicitud de patente internacional N° PCT/US98/18600 describe el cultivo de una línea celular que puede producir un vector de rAAV después de la infección con un virus helper; infectar las células con un virus helper, tal como adenovirus; y Usar las células. AAV y otros métodos y sistemas de producción virales también se describen, por ejemplo, en los documentos WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825

(PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar una población de partículas de virus, que comprende la etapa de:

a) Incubar una célula productora en un medio de cultivo celular y monitorizar y ajustar al menos una condición para fomentar la liberación de partículas de virus de la célula, con lo que las partículas de virus son liberadas de la

célula productora al medio de cultivo sin Usar las células, en el que la condición que fomenta la liberación de partículas de virus comprende una o más condiciones seleccionadas de pH, osmolalidad y temperatura, y

b) recolectar las partículas virales del medio de cultivo celular sin Usar las células, obteniendo con ello una población de partículas virales; en donde el virus es virus adeno-asociado (AAV).

2. El método de la reivindicación 1, en el que el virus es virus es virus adeno-asociado recombinante (rAAV), y en el que la célula productora comprende:

(I) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, en donde cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV;

(li) un vector de AAV recomblnante (rAAV) que comprende un polinucleótido heterólogo no AAV flanqueado por al menos una repetición terminal Invertida (ITR) de AAV; y (¡II) un virus helper para AAV.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la condición que fomenta la liberación de virus es una combinación de osmolalidad y temperatura.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la condición que fomenta la liberación de virus es la osmolalidad.

5. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la osmolalidad se mantiene en 200 mOsm a 400 mOsm.

6. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la osmolalidad es 300 mOsm.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la osmolalidad inicial del cultivo celular es

300 mOsm.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la osmolalidad del cultivo celular se ajusta 25 utilizando NaCI u otra sal, mañosa o glucosa, preferiblemente se ajusta utilizando NaCI.

9. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la condición que fomenta la liberación de virus es la temperatura.

10. El método de la reivindicación 3 ó 9, en el que la temperatura es 37 °C a aproximadamente 40 °C.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la temperatura es 39 °C.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células productoras se cultivan 30 durante 48 a 96 horas después de la Introducción de la función de virus helper.

13. El método de la reivindicación 2, en el que la función de virus helper se proporciona por virus helper o por una secuencia de polinucleótidos de dicho virus helper que codifica al menos una función de virus helper.

14. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho virus helper es un adenovlrus, virus herpes o virus de la viruela, opcionalmente en el que dicho virus helper es virus

herpes simplex, virus Epsteln-Barr, citomegalovirus o virus de la pseudorrabia.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, que comprende, además, las etapas de:

c) cromatografiar el medio de cultivo de células productoras de AAV en al menos una cromatografía de intercambio de aniones cargada positivamente; y

d) purificar las fracciones cromatográficas que contienen partículas de rAAV de la etapa c) mediante 40 cromatografía de intercambio de cationes o filtración en flujo tangencial para generar una población purificada de

partículas de vector de rAAV.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la etapa (d) es una cromatografía de intercambio de cationes.

17. El método de la reivindicación 15, en el que la etapa (d) es una filtración en flujo transversal.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, que comprende, además, las etapas de:

c) cromatografiar el medio de cultivo de células productoras de AAV en una cromatografía de Intercambio de cationes; y

d) purificar las fracciones cromatográficas que contienen partículas de rAAV de la etapa c) mediante cromatografía de intercambio de aniones; y

e) purificar las fracciones cromatográficas que contienen partículas de rAAV de la etapa d) mediante cromatografía con sulfato de heparina para generar una población purificada de partículas de vector de rAAV.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, que comprende, además, las etapas de cromatografiar el medio de cultivo de células productoras de AAV en una pluralidad de cromatografías de intercambio de iones, que comprenden al menos una cromatografía de intercambio de aniones cargada positivamente y al menos una cromatografía de intercambio de cationes cargada negativamente para generar una población purificada de partículas de vector de rAAV.

20. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que dicho vector de rAAV comprende un polinucelótido no AAV heterólogo flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV.

21. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que dicha célula productora de AAV comprende al menos un gen de empaquetamiento de AAV que está establemente integrado en el genoma de dicha célula productora de AAV.

22. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que dicha célula productora de AAV comprende un gen rep de AAV y un gen cap de AAV.

23. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho gen cap de AAV y gen cap de AAV está establemente Integrado en el genoma de dicha célula productora de AAV.

24. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que la célula productora es una línea celular de mamífero dependiente de la fijación.

25. Un método de generar una población de partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que la célula productora es una línea celular de mamífero adaptada en suspensión.