Método para preparar hipoalérgenos.

Método para la producción de un polipéptido alergénico modificado,

comprendiendo el método las etapas de:

(a) modificar una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido alergénico que comprende una superficie plana de modo que en el polipéptido expresado a partir del ácido nucleico modificado, la estructura de la superficie plana de dicho polipéptido está alterada;

(b) expresar o producir el polipéptido alergénico modificado a partir del ácido nucleico modificado; y

(c) seleccionar aquellos polipéptidos alergénicos modificados frente a los cuales un anticuerpo IgE específico de dicho polipéptido alergénico presenta una afinidad al menos diez veces inferior;

en donde dicha superficie plana tiene un área de 600-900 Å2 y se determina mediante análisis con ordenador como que es el epítopo alergénico de la ß-lactoglobulina definido por la estructura o las coordenadas 3D de los aminoácidos de la ß-lactoglobulina (SEQ ID NO: 8) Val43-Lys47 y Leu57-Gln59 en un inmunocomplejo de anticuerpo-ß-lactoglobulina según la Tabla VIII.

Método para preparar hipoalérgenos Campo de la invención

Esta memoria descriptiva se refiere a la tecnología de ingeniería genética de proteínas. Más particularmente, la presente memoria descriptiva se refiere a anticuerpos IgE humanos y derivados de los mismos, que se unen a un epítopo alergénico no continuo, una superficie plana con un área de 6-9 A2, por ejemplo, los anticuerpos IgE que se unen a (3-lactoglobulina de leche bovina con afinidad y especificidad elevadas. La presente memoria descriptiva también se refiere a procedimientos para la preparación y la modificación por ingeniería genética de tales anticuerpos monoclonales que se unen a alérgenos, con una interacción de Tipo I y a métodos para usar estos anticuerpos y derivados de los mismos en el campo del inmunodiagnóstico, lo que permite una determinación cualitativa y cuantitativa y una eliminación de sustancias alergénicas de muestras de material biológico y de materias primas, así como la construcción de genotecas de IgE dirigidas a alérgenos; lo que permite el desarrollo de anticuerpos específicos de alérgenos. En la inmunoterapia, la presente memoria descriptiva permite el bloqueo de la interacción de superficie de Tipo I de sustancias alergénicas mediante la modificación de residuos de aminoácidos de los alérgenos. Una variante hipoalergénica se puede obtener mediante la mutación de algunos residuos de aminoácidos (1-5) en la superficie planar (plana) del epítopo con residuos voluminosos (tales como Arg, Tyr, Lys, Trp). Los residuos mutados son aquellos en los que las cadenas laterales están apuntando hacia fuera hacia el disolvente, causando así un cambio mínimo en la estructura básica del alérgeno. La finalidad de la mutagénesis es modificar la superficie plana a una superficie convexa que impide la unión de anticuerpos IgE. El alérgeno modificado resultante se puede utilizar para provocar la tolerancia contra alérgenos particulares en pacientes alérgicos. La presente memoria descriptiva permite el desarrollo de anticuerpos obtenidos a partir de una región VH de IgE humana para dianas terapéuticas y de diagnóstico, en donde la especificidad de la unión es hacia áreas de estructuras proteicas que no se encuentran en las regiones que sobresalen de la superficie. La memoria descriptiva también proporciona medios para la detección o el diseño de modelos moleculares de sustancias capaces de bloquear la unión de un anticuerpo al epítopo alergénico de Tipo I. En esta memoria descriptiva también se describe el desarrollo, la caracterización y la determinación de la estructura del fragmento de anticuerpo humano IgE y derivados del mismo que se unen a la (3-lactoglobulina alergénica, con una afinidad y especificidad suficientemente altas para ser utilizados como reactivos en inmunoensayos.

Antecedentes de la invención

Casi el 2% de la población mundial padece alergia. En consecuencia, es un problema sanitario con una gravedad en aumento. La alergia es una reacción de hipersensibilidad frente a sustancias en el aire, los alimentos o el agua, que normalmente son inofensivas (Corry y Kheradmand, 1999). Un nuevo agente externo y extraño desencadena una reacción alérgica, que tiene por objeto la eliminación de ese agente del cuerpo. En las reacciones alérgicas mediadas por IgE, también llamadas reacciones de hipersensibilidad inmediata o de tipo I, después de la primera vez que se expone el organismo a una sustancia extraña, el alérgeno, los linfocitos B portadores de IgE comienzan a producir moléculas de IgE solubles que se unirán después a receptores de IgE de afinidad elevada, presentes en la superficie de una amplia variedad de células, de manera importante a mastocitos y basófilos. Si hay de nuevo un encuentro con la misma sustancia extraña, se produce la reticulación de las moléculas de IgE unidas al receptor a través del alérgeno, lo que da como resultado una activación celular seguida por la liberación de productos tóxicos como la histamina, lo que provocará los signos y síntomas de una reacción alérgica.

La alergia a la leche de vaca (CMA) es una de las causas más comunes de reacciones adversas de importancia clínica a los alimentos, en bebés y niños durante los 2 primeros años de vida (Savilahti, 1981; Host y Halken, 199; Saarinen et al., 1999). Se caracteriza por una fuerte respuesta de IgE a las proteínas de la leche y síntomas clínicos en la piel y el tracto gastrointestinal, tales como eczema atópico, vómitos y diarrea (Vaarala et al., 1995; Saarinen, 2). Los síntomas en las vías respiratorias y choque anafiláctico también son posibles (Host y Halken, 199; Schrander et al., 1993; Hill et al., 1999; Vanto et al., 1999; Saarinen, 2). La CMA es un problema serio en los niños, ya que la leche es una importante fuente de energía (hasta el 5%) para los niños pequeños y no se puede reemplazar muy fácilmente con productos no lácteos. Casi el 85% de los niños alérgicos a la leche superará su alergia a la edad de 3 años, pero puede tener lugar una remisión de la CMA hasta en un tercio de los niños de más edad (Sampson y Scanlon, 1989).

Uno de los principales alérgenos en la leche de vaca es la (3-lactoglobulina, que pertenece a la familia de proteínas conocida como lipocalinas. Las lipocalinas consisten en un grupo de proteínas que se unen a un ligando pequeño, principalmente alérgenos respiratorios tales como Mus mi, Rat n1 (proteínas urinarias de ratón y rata) y un alérgeno de cucaracha alemana Bla g4 (Rouvinen et al. 21). La (3-lactoglobulina se produce naturalmente en forma de un dímero de 36 kD, teniendo cada subunidad 162 aminoácidos. Se han identificado en total seis variantes genéticas de la (3-lactoglobulina basándose en diferencias de la secuencia. Las variantes más prevalentes A y B solo se diferencian en la posición 64 (Asp Gly) y 118 (Val Ala) (Godovac-Zimmermann y Braunitzer, 1987). La estructura 3D de la (3-lactoglobulina se ha determinado por difracción de rayos X (Sawyer L. et al., 1985, Brownlow, S. et al., 1997).

Los anticuerpos IgE reconocen de forma distintiva epítopos alergénicos, que serían útiles en aplicaciones clínicas y de inmunodiagnóstico para la detección y la determinación de las concentraciones de alérgenos de materiales complejos. Además, de acuerdo con esta memoria descriptiva, los epítopos alergénicos son generalmente diferentes de los epítopos inmunogénicos de proteínas. Este hecho ha obstaculizado la producción de anticuerpos 5 monoclonales capaces de unirse específicamente a epítopos alergénicos por metodología convencional, tal como la tecnología de hibridoma. Se ha mostrado recientemente que es posible el desarrollo de anticuerpos IgE específicos de alérgenos gracias a la tecnología de presentación en fagos (Steinberger et al., 1996). Esta metodología está aportando nuevas herramientas para producir anticuerpos recombinantes específicos de alérgenos que se pueden producir con una calidad constante para aplicaciones clínicas y de diagnóstico.

El problema técnico con el que se relaciona la presente memoria descriptiva es la detección de sitios de unión reales de los anticuerpos IgE en polipéptidos alergénicos y el uso de esta información, por ejemplo, para modificar estos polipéptidos para disminuir su alergenicidad. Las soluciones previas a este problema se describen en el documento de Solicitud de Patente de Estados Unidos n° 23/175312 (Holm et al.), WO 3/96869 (AIK Abello A/S) y Jenkins et al. 25 (J. Allergy Clin. Immunol. 115:163- 17). En estos documentos, se describe que los supuestos sitios de 15 unión a IgE en polipéptidos alergénicos se pueden detectar mediante análisis de la secuencia de estructuras conservadas de la superficie de los polipéptidos alergénicos. Además, en el documento US 25/181446 (Roggen et al.) y Hantusch et al. 24 (J. Allergy Clin. Immunol.) se utiliza una metodología de exploración de péptido para encontrar epítopos que se unen a IgE. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe un método en el que se encuentra un sitio de unión a IgE en un polipéptido alergénico, basándose en los datos de formación de modelos 3D 2 experimentales y moleculares de un nuevo tipo de epítopo de IgE, que tiene naturaleza esencialmente planar o plana. MacCallum et al. 1996 (J. Mol. Biol. 262:732-745) describen la presencia de superficies planas en anticuerpos, pero ilustran una sola modificación de las estructuras del anticuerpo, no de las estructuras de antígeno. Además, la descripción de MacCallum et al. se dirige a anticuerpos y a diferentes tipos de antígenos, tales como hidratos de carbono y péptidos, en general y no describe nada en particular sobre la unión entre los anticuerpos IgE 25 y polipéptidos alergénicos o las estructuras superficiales de estos polipéptidos.

1. Método para la producción de un polipéptido alergénico modificado, comprendiendo el método las etapas de:

(a) modificar una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido alergénico que comprende una superficie plana de modo que en el polipéptido expresado a partir del ácido nucleico modificado, la estructura de la superficie plana de dicho polipéptido está alterada;

(b) expresar o producir el polipéptido alergénico modificado a partir del ácido nucleico modificado; y

(c) seleccionar aquellos polipéptidos alergénicos modificados frente a los cuales un anticuerpo IgE específico de dicho polipéptido alergénico presenta una afinidad al menos diez veces inferior;

en donde dicha superficie plana tiene un área de 6-9 A2 y se determina mediante análisis con ordenador como que es el epítopo alergénico de la (3-lactoglobulina definido por la estructura o las coordenadas 3D de los aminoácidos de la (3-lactoglobulina (SEQ ID NO: 8) Val43-Lys47 y Leu57-Gln59 en un inmunocomplejo de ant¡cuerpo-|3-lactoglobul¡na según la Tabla VIII.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido alergénico se selecciona a partir del grupo que consiste en:

a) Bos d 5, beta-lactoglobulina;

b) Equ c 1, piel de caballo;

c) Bet v 1, polen de abedul;

d) Bos d 2, descamaciones de bovino;

e) Cyp c 1, parvalbúmina de carpa; y

f) Hev b 6, látex.

3. Método para la producción de un polipéptido alergénico modificado, comprendiendo el método las etapas de:

(a) detectar por técnicas de análisis estructural o de formación de modelos moleculares un sitio de unión potencial a una IgE en un polipéptido alergénico;

(b) determinar por análisis con ordenador de una estructura tridimensional de dicho polipéptido alergénico, si dicho sitio de unión potencial a una IgE contiene un área de superficie planar o plana de 6-9 A2 como la superficie plana definida por las coordenadas 3D de los aminoácidos de (3-lactoglobulina (SEQ ID NO: 8) Val43-Lys47 y Leu57-Gln59 en un inmunocomplejo de anticuerpo-(3-lactoglobulina según la Tabla VIII, si se encuentra una superficie planar o plana tal como la de la (3-lactoglobulina, el método continúa con

(c) modificar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho polipéptido de modo que en el polipéptido expresado a partir del ácido nucleico modificado, la estructura de la superficie planar o plana de dicho polipéptido está alterada;

(e) expresar o producir un polipéptido alergénico modificado a partir del ácido nucleico modificado obtenido a partir de la etapa c).