Método para la inmovilización de una molécula de captura sobre un soporte sólido.

Método para la inmovilización de una molécula de captura sobre un soporte sólido,

en el que la molécula de captura se une covalentemente a una molécula de biotina para obtener una molécula de captura biotinilada y en el que la molécula de captura biotinilada se pone en contacto primero con un miembro de unión para formar un complejo de molécula de captura, en el que el complejo se pone en contacto con el soporte sólido.

Método para la inmovilización de una molécula de captura sobre un soporte sólido Campo de la invención

Esta Invención se encuentra en el campo de ensayos de diagnóstico, más en particular inmunoensayos, en donde una molécula de captura se Inmoviliza sobre un soporte sólido con el fin de capturar un anallto.

Antecedentes de la técnica

Uno de los principales objetivos de los Investigadores en los campos del diagnóstico (clínico) y los programas de control de la contaminación consiste en proporcionar nuevas estrategias analíticas para obtener datos precisos lo más rápidamente posible. Cuando se requiere un nuevo ensayo de rastreo con fines comerciales, el método tiene que ser sensible, específico, rápido, barato y fácil de realizar. En general, las técnicas ¡nmunológicas (Inmunoensayos) pueden satisfacer estas necesidades en gran medida.

Durante la última década, Inmunoensayos de flujo lateral de un solo uso han tenido un éxito extremo tanto en los entornos de laboratorio, clínica ambulatoria como de atención primaria. En este tipo de ensayos, típicamente todos los componentes de la reacción pueden estar impregnados o Inmovilizados sobre una fase sólida porosa, habltualmente una membrana de nltrocelulosa, y se ponen en contacto con la muestra, opcionalmente después de la adición de un diluyente (Zuk RF, Glnsberg VK, Houts T et al. (1985) Clin Chem 31:1144-115, Bunce RA, Thorpe GH, Keen L (1991) Anal Chlm Acta 249:263-269, y May K (1994) En: D Wlld (comp.): The Immunoassay Handbook. Macmlllan Press, Londres, 233-235).

Este formato de inmunoensayo también se conoce como ensayo de la tira, ensayo de la tira de una etapa, ensayo inmunocromatográfico, diagnóstico de flujo rápido, inmunoensayo rápido (test), Inmunoensayo de flujo lateral (LFI), test en el sitio (ensayo) o test cercano al paciente (NPT).

Los inmunoensayos son sistemas de medición analíticos que se basan en la unión entre antfgenos y anticuerpos para la detección de analitos específicos en muestras tales como, por ejemplo, muestras clínicas.

En un inmunoensayo típico, los antfgenos o anticuerpos se unen habitualmente a algún tipo de etiqueta y luego se utilizan como un reactivo de detección para detectar el analito. A un reactivo de detección tal como un anticuerpo o antígeno se le alude habitualmente como un conjugado. La etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta radiactiva o una enzima para la detección colorimétrica o una partícula coloidal de color tales como oro, carbono, sílice o látex para la visualización directa de la inmunorreacción (Leuvering JHW, Thal PJHM, Van der Waart M, Schuurs AHWM (198) J Immunoassay 1(1): 77-91).

En la práctica, partículas de oro coloidal o nanorracimos de oro que tienen un diámetro de 25-4 nm son probablemente las etiquetas más comúnmente empleadas en inmunoensayos de flujo lateral (Verheijen, R., en: Analytical Biotechnology 22, editorial Birkhauser Comp: T. Schalkhammer págs. 134-166).

Un inmunoensayo típico comprende una tira de ensayo tal como la ¡lustrada en la figura 1. Una tira de ensayo de este tipo puede estar montada en una carcasa de plástico tal como la ¡lustrada en la figura 2.

En un entorno comercial, una tira de ensayo típica puede estar compuesta de un cierto número de componentes, incluyendo una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, una almohadilla absorbente y una membrana de flujo lateral que contiene los reactivos de captura en la zona de captura, habitualmente en forma de dos líneas de captura; una línea de ensayo y una línea de control. El reactivo de captura está inmovilizado típicamente sobre la membrana de flujo lateral. El reactivo de captura en el ensayo comprende una molécula que es capaz de unirse al (de capturar el) analito. A esta molécula se la alude en esta memoria como una molécula de captura.

El propósito principal de la carcasa es fijar los diversos componentes de la tira de ensayo y mantenerlos en estrecho contacto unos con otros. Además, la carcasa puede determinar las dimensiones del pocilio de muestra y contiene habitualmente la ventana de visualización con indicaciones de lectura.

Al describir el principio del inmunoensayo, se tiene que distinguir entre el ensayo directo que se utiliza habitualmente para detectar analitos de alto peso molecular tales como proteínas, y el ensayo indirecto o competitivo, habitualmente utilizado para detectar analitos de baja masa molecular tales como residuos de fármacos, antibióticos, hormonas, etc.

En ambos tipos de ensayos, el usuario dispensa una muestra de líquido (extracto de tampón, leche, orina, suero, plasma, sangre entera, etc.) a la almohadilla de muestra. En un ensayo típico, la muestra fluye entonces a través de la almohadilla de muestra hacia la almohadilla de conjugado en donde se libera y se mezcla con el conjugado. También son conocidas en la técnica otras configuraciones, por ejemplo en los casos en los que la muestra se pone en contacto primero con los reactivos de captura y el conjugado se pone subsiguientemente en contacto con la región de captura (Verheljen, R., en: Analytlcal Blotechnology 22, editorial Birkhauser Comp.: T. Schalkhammer págs. 134-166).

Los ensayos de flujo lateral disponibles en la actualidad emplean a menudo conjugados que se encuentran adyacentes a o aguas abajo del punto de deposición de la muestra (figura 1). La muestra en sí es Invocada para volver a suspender el conjugado de la almohadilla de conjugado y llevarlo a la zona de captura. Inmunoensayos de este tipo pueden requerir un tamaño de muestra relativamente grande con el fin de proporcionar un flujo adecuado de la muestra y el conjugado.

Alternativamente, el conjugado puede estar situado aguas arriba del punto de deposición de la muestra. Inmunoensayos de este tipo requieren un volumen de muestra mucho menor. Diluyente adicional se puede añadir luego para volver a suspender el conjugado de la almohadilla de conjugado y para proporcionar un flujo adecuado de la muestra y el conjugado a la zona de captura.

Téngase en cuenta que "aguas arriba" y "aguas abajo" se refieren a la posición de un elemento con relación a la dirección de flujo de una muestra en el inmunoensayo.

En el formato de ensayo directo para la detección de analitos de alta masa molecular tales como proteínas, el conjugado puede consistir en nanorracimos de oro recubiertos con anticuerpos específicos reactivos con el analito. Si ese analito está presente en la muestra, reaccionará con el conjugado. Los complejos de analito-conjugado formados son móviles y son capaces de moverse libremente de la almohadilla de conjugado a la membrana con el flujo del fluido. En la línea de ensayo, los complejos serán capturados por la molécula de captura tal como anticuerpos anti-analito inmovilizados. Por lo tanto, la presencia del analito en la muestra resultará en una línea de ensayo de color. La intensidad del color de la línea de ensayo puede ser proporcional a la concentración del analito en la muestra.

Cuando la concentración de la proteína de interés es menor que la concentración de detección más baja o cuando el analito está completamente ausente, no será visible línea de ensayo alguna. El exceso de muestra que fluye más allá de las líneas de ensayo y control se recoge en la almohadilla absorbente (Verheijen, R., en: Analytical Biotechnology 22, editorial Birkhauser Comp.: T. Schalkhammer, págs. 134-166).

En el formato de ensayo competitivo para la detección de analitos de bajo peso molecular, el conjugado consiste en nanorracimos de oro recubiertas con anticuerpos contra el analito. La línea de ensayo consiste en este caso en el analito acoplado a la denominada proteína de soporte. Cuanto más analito esté presente en la muestra, más eficazmente competirá con el analito inmovilizado en la membrana por la unión a la cantidad limitada de anticuerpos del conjugado. Así, la ausencia del analito en la muestra resultará en una línea de ensayo de color, mientras que un aumento en la cantidad de analito resultará en una disminución de la señal en la zona de detección. A una cierta concentración de analito en la muestra, la línea de ensayo ya no será visible. El límite de detección se define como la cantidad de analito en la muestra que sólo causas una invisibilidad total de la línea de captura de ensayo.

Inmunoensayos que comprenden una tira de ensayo están disponibles comercialmente para un número creciente de analitos (de alta y baja masa molecular). El primer analito diana importante para este formato de ensayo fue la gonadotropina coriónica humana (HCG) para la detección del embarazo. En la actualidad, está disponible una gran diversidad de inmunoensayos (Anónimo, Syllabus of a two-day... [Seguir leyendo]

1. Método para la inmovilización de una molécula de captura sobre un soporte sólido, en el que la molécula de captura se une covalentemente a una molécula de biotina para obtener una molécula de captura biotlnllada y en el que la molécula de captura biotlnllada se pone en contacto primero con un miembro de unión para formar un

complejo de molécula de captura, en el que el complejo se pone en contacto con el soporte sólido.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el miembro de unión es un miembro de unión de alta afinidad seleccionado del grupo que consiste en avidina, captavidina, estreptavidina, neutravidina o estreptavidina-hidrazida o derivados de las mismas.

3. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la molécula de captura es una molécula pequeña.

4. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3, en el que la molécula de captura es un péptido.

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 4, en el que la molécula de captura es un antígeno reactivo con anticuerpos obtenidos de pacientes que padecen artritis reumatoide.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula de captura es un péptido cltrullnado cíclico.

7. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que el soporte sólido es una membrana de nltrocelulosa.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el soporte sólido es una membrana de flujo rápido.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la membrana se selecciona del grupo que consiste en

Millipore HF75, HF9, HF12, HF135, HF18 o HF24 o membranas con propiedades de flujo equiparables o

equivalentes.

1. Un soporte sólido con un complejo de molécula de captura inmovilizado sobre el mismo, obtenido mediante el 2 método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9.

11. Inmunoensayo para la detección de anticuerpos o antígenos que comprenden un soporte sólido de acuerdo con

la reivindicación 1.

12. Inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 11 para la detección de anticuerpos específicos para la artritis reumatoide.

13. Inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde un péptido citrulinado cíclico está inmovilizado

sobre el soporte sólido.