Método para aislar una célula cancerosa resistente a agentes quimioterapéuticos con propiedades de célula madre.

Un método para aislar una célula cancerosa resistente a agentes quimioterapéuticos con propiedades de célula madre,

que comprende:

(i) encapsular una muestra de células cancerosas en una perla que contiene agarosa recubierta con agarosa;

(ii) poner en contacto dicha perla con al menos un agente quimioterapéutico contra el cáncer durante un tiempo suficiente para destruir al menos una porción de dichas células cancerosas;

(iii) eliminar cualquier célula superviviente de dicha perla;

(iv) ensayar dicha célula superviviente para al menos una propiedad de célula madre, y

(v) aislar cualquier célula que presente dicha propiedad de célula madre de cualquier célula que no.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/061812.

Solicitante: THE ROGOSIN INSTITUTE, INC.

Inventor/es: SMITH, BARRY, GAZDA,LAWRENCE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01N43/02 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES (mezclas de pesticidas con fertilizantes C05G). › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m ≥ 1 y n ≥ 0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › que contienen ciclos con uno o varios átomos de oxígeno o de azufre como únicos heteroátomos del ciclo.

PDF original: ES-2534374_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para aislar una célula cancerosa resistente a agentes quimioterapéuticos con propiedades de célula madre Solicitudes relacionadas

[1] La presente solicitud reivindica prioridad de las solicitudes de patente provisionales 61/458.39 y 61/458.391, presentadas ambas el 23 de noviembre de 21, e incorporadas por referencia en su totalidad.

Campo de la invención

[2] La presente invención se refiere a métodos para aislar células madre cancerosas. También se refiere a métodos para cribar compuestos de interés para determinar si tienen posible eficacia como agentes antitumorales.

Antecedentes y estado de la técnica

[3] La mayoría de muertes por cáncer tras quimioterapia y remisión resultan de la reaparición del tumor tratado original o tumores. Esto parece ser algo contradictorio, ya que las terapias para el cáncer conocidas eliminan algunas veces, pero no siempre, tumores hasta tal punto que un paciente puede declararse "curado".

[4] Una teoría que se ha adelantado para explicar la reaparición de tumores, además del crecimiento tumoral de por sí, es la teoría de la "célula madre cancerosa" o "CMC". En resumen, esta teoría plantea que una rara población de células cancerosas que poseen algunas características de células madre experimentan división asimétrica que a su vez conduce a células madre de sustitución, y a poblaciones de linaje más limitado de células amplificadoras de tumores. Estas "nuevas" células proliferan rápidamente, y constituyen la mayoría del tumor, a diferencia de las células madre, que son de ciclo lento, quiescentes, y son resistentes a terapias que se dirigen rápidamente a células en división. El resultado de esto es que mientras que la mayoría de las células en un tumor son susceptibles a una o más de estas terapias dirigidas, la pequeña población de células cancerosas quimiorresistentes similares a células madre no se destruyen, y se repite el ciclo tratado anteriormente.

[5] Claramente, hay una necesidad de identificar estas células cancerosas similares a células madre, además de una necesidad de cuantificar su presencia en tumores de un sujeto particular o paciente. Por tanto, mientras que el campo de la oncología reconoce varias quimioterapias para el cáncer, "una talla no sirve para todos", y sigue existiendo la necesidad de desarrollar terapias dirigidas, además de un método más general para identificar fármacos antitumorales posiblemente útiles.

[6] Las patentes de EE.UU. n2 5.888.497; 6.33.151; 6.88.75; 6.818.23; 7.41.54; y 7.297.331, todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad, describen métodos para encapsular células cancerosas en perlas de agarosa, que a su vez están recubiertas con agarosa. El tipo de agarosa puede variar, como se muestra en el contexto de otros tipos de células (islotes), como por, por ejemplo, la solicitud publicada 27/71732, también incorporada por referencia en su totalidad.

[7] Los trabajos en estos encapsulados de células cancerosas ha conducido a la observación de que se desarrollan poblaciones de células que podrían poseer propiedades paralelas a las de las células madre. Así, era de interés determinar si los materiales descritos en estas referencias podrían usarse para aislar células cancerosas resistentes a la quimioterapia, que también poseyeran propiedades similares a células madre. Como resultado, también se aprendió que estos encapsulados podrían usarse para cribar compuestos de interés para determinar si el compuesto era eficaz contra cánceres.

[8] Cómo se alcanzan estos y otros aspectos de la invención se observará en la siguiente divulgación. Descripción detallada de realizaciones preferidas

Ejemplo 1

[9] Se prepararon perlas de agarosa recubiertas con agarosa, que contenían células RENCA según Smith y col., Cañe Res., 71(3): 716-724 (211); y Smith y col., Cañe. Res. 71(3): 725-735 (211), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia. Las perlas resultantes se cultivaron en medio durante 12 semanas.

[1] A continuación, las muestras de perlas se expusieron a un único fármaco contra el cáncer conocido, a una de tres concentraciones variables. La exposición implicó la incubación de las perlas en presencia del fármaco durante un periodo de tiempo basado en la semivida conocida del fármaco.

[11] Tras la incubación, las perlas se lavaron dos veces y se transfirieron a medio de cultivo sin tratamiento previo. También se prepararon controles, que incluyeron perlas sin tratar, además de perlas expuestas a cualquier vehículo usado para solubilizar el fármaco.

[12] Se realizó el examen histológico de las perlas una semana tras la exposición al fármaco. En algunos casos, no hubo cambio, mientras que en otros, el fármaco produjo la pérdida completa de la viabilidad celular y en otros, y hubo un efecto intermedio. Los resultados son los siguientes:

Agente

Tiempo de tratamiento

Dosis

Efecto

ng/ml

-

Cisplatino

1 h

6 ng/ml

-

6 ng/ml

-

pg/ml

+/-

Carboplatino

días

25 pg/ml

+

25 ug/ml

+

,45 ug/ml

-

Metotrexato

1 día

4,5 ug/ml

-

ug/ml

-

pg/ml

+

Doxorubicina

2 días

pg/ml

+

1 ug/ml

+

,1 pg/ml

-

Vinorelbina

2 días

1 pg/ml

+/-

ug/ml

+/-

,5 ug/ml

+/-

Docetaxel

1 día

ug/ml

+/-

ug/ml

+/-

,35 ug/ml

-

Paclitaxel

1 día

3,5 ug/ml

+/-

ug/ml

+/-

Ejemplo 2

[13] El tratamiento con docetaxel y paclitaxel no destruyó todas las células dentro de las colonias de tumor encapsulado, y así las perlas que se habían tratado con estos fármacos se seleccionaron para estudio adicional. También podrían haberse usado perlas tratadas con carboplatino a una baja concentración, o vinorelbina, a una concentración intermedia.

[14] Las perlas tratadas con paclitaxel y docetaxel se cultivaron bajo condiciones estándar, ya que fueron perlas de control que se habían expuesto a DMSO, que era el vehículo para la administración de los dos fármacos. El periodo de cultivo fue 18 semanas.

[15] Las células encapsuladas en perlas tratadas con DMSO mostraron morfología normal, que es colonias de tumor elípticas, que consisten en un borde de células, 1-2 células de espesor, que rodea el residuo interno. A diferencia, las perlas que se habían tratado con 3,5 ug/ml de paclitaxel mostraron una pérdida de células durante 6 semanas, con un regreso al número previo al tratamiento de células en la semana 18. Las perlas tratadas con docetaxel (5 pg/ml) mostraron un patrón coherente de solo 1-2 células por colonia, 6 semanas después del tratamiento. Aproximadamente el 1 % de las perlas desarrollaron 1 ó 2 colonias grandes, en la semana 18.

[16] Con el fin de cuantificar la pérdida de células, se seccionaron y se tiñeron perlas representativas de los grupos de control de DMSO, de paclitaxel y de docetaxel, usando métodos convencionales, con el fin de permitir el recuento de núcleos de células. Los resultados se normalizaron a las perlas tratadas con DMSO.

[17] En el caso del tratamiento con paclitaxel, hubo una pérdida inicial durante las semanas 1-3 de aproximadamente el 25 % de células por colonia. La mayoría de las colonias... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para aislar una célula cancerosa resistente a agentes quimioterapéuticos con propiedades de célula madre, que comprende:

(i) encapsular una muestra de células cancerosas en una perla que contiene agarosa recubierta con agarosa;

(¡i) poner en contacto dicha perla con al menos un agente quimioterapéutico contra el cáncer durante un tiempo suficiente para destruir al menos una porción de dichas células cancerosas;

(iii) eliminar cualquier célula superviviente de dicha perla;

(iv) ensayar dicha célula superviviente para al menos una propiedad de célula madre, y

(v) aislar cualquier célula que presente dicha propiedad de célula madre de cualquier célula que no.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha propiedad de célula madre es expresión de OCT4.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente quimioterapéutico es docetaxel.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células cancerosas son células de mamífero.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dichas células de mamífero son células humanas.

6. Un método para determinar si una sustancia de interés tiene eficacia contra el cáncer, que comprende poner en contacto dicha sustancia con una muestra de células cancerosas encapsuladas en una perla recubierta con agarosa que contiene agarosa y comparar el porcentaje de dichas células cancerosas destruido por dicha sustancia con el porcentaje de dichas células cancerosas encapsuladas en una perla recubierta con agarosa que contiene agarosa no puestas en contacto con dicha sustancia, en el que un mayor porcentaje destruido por dicha sustancia es indicativo de eficacia contra el cáncer para dicha sustancia.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dichas células cancerosas son células cancerosas de mamífero.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dichas células cancerosas de mamífero son células cancerosas humanas.

9. El método de la reivindicación 6, en el que dichas células cancerosas son células madre cancerosas.

1. El método de la reivindicación 6, que comprende además poner en contacto dicha sustancia con dicha muestra de células cancerosas a una concentración predeterminada y un periodo de tiempo predeterminado, determinar el porcentaje de dichas células cancerosas destruido por dicha sustancia y comparar dicho porcentaje con el porcentaje de dichas células cancerosas encapsuladas en una perla recubierta con agarosa que contiene agarosa destruido por un agente de control, en el que un mayor porcentaje destruido por dicha sustancia es indicativo de eficacia contra el cáncer para dicha sustancia.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células cancerosas son células madre cancerosas.


 

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