Método de control de una reacción de modificación de polipéptidos.

Un método para controlar la autoactivación del factor VII, o de un análogo o derivado de éste,

que comprende los pasos de:

(a) medir la concentración inicial del factor VII/VIIa, o del análogo o derivado de éste;

(b) medir la proporción inicial del factor VII activado, o del análogo o derivado de éste;

(c) calcular el tiempo de reacción de la activación del factor VII, o del análogo o derivado de éste, mediante correlación de los valores medidos en cada uno de los pasos (a) y (b) con un valor de la proporción requerida del factor VII activado, o del análogo o derivado de éste, donde el tiempo de reacción, t, se calcula según la fórmula (I):**Fórmula**

en la que "akt" se refiere a la proporción requerida de factor VII escindido, o del análogo o derivado de éste, "akt0" se refiere a la proporción inicial de factor VII escindido, o del análogo o derivado de éste, medida en el paso (b), "F0" se refiere a la concentración inicial del factor VII, o del análogo o derivado de éste, (en g/l) medida en el paso (a), k(T) se refiere a la constante de reacción para la reacción dada (en L/g/min) como una función de la temperatura, T, y xb se refiere a la fracción molar, calculada según la ecuación de la fórmula (III),**Fórmula**

en la que pH se refiere al pH elegido de la reacción;

(d) realizar, a un pH de 6.0 a 8.0, la reacción de activación del factor VII durante el tiempo calculado en el paso (c); y

(e) finalizar la reacción después del tiempo de reacción calculado en el paso (c), finalización que comprendereducir el pH a un valor por debajo de aproximadamente 6.0, como por ejemplo entre 5.5 y 6.0.

Método de control de una reacción de modificación de polipéptidos Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a un método de control de una reacción de modificación de polipéptidos, en particular pero no exclusivamente, a un método de control de la activación del factor Vil humano (FVII) para producir factor Vll(a) humano (FVII(a)). La invención también se refiere a polipéptidos que se pueden obtener mediante la reacción de modificación de polipéptidos y a composiciones farmacéuticas que contienen dichos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

[0002] La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una compleja interacción de diversos componentes (o factores) sanguíneos que finalmente da lugar a un coágulo de fibrina. En general, los componentes sanguíneos, que participan en la que ha sido denominada "cascada" de la coagulación, son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que en sí mismo es un factor de la coagulación activado). Los factores de la coagulación que han sufrido dicha conversión se denominan generalmente "factores activos" y se designan mediante la adición de la letra "a" al nombre del factor de la coagulación (porej. Factor Vll(a))

[0003] FVII (también conocido como FVII monocatenario, FVII inactivado o zimógeno) es una única cadena polipeptídica, que por escisión proteolítica del enlace peptídico entre Arg152 e Ile153 se convierte en la forma activada: FVII(a). Esta reacción puede ser catalizada por autoproteólisis de FVII(a) o por otras enzimas como FXa o el veneno de la víbora de Russel. La autoactivación tiene la ventaja de que no se necesita agregar ni extraer físicamente ninguna enzima al final del proceso

[0004] Es muy importante poder controlar la activación de FVII cuidadosamente, dado que el contenido de los productos de degradación de la cadena pesada (AA290 y AA315) aumenta drásticamente una vez que se alcanza una proporción de activación de más del 99% (es decir, una vez que se agota el sustrato preferido de Arg 152). Por lo tanto, es crucial no sobreactivar el producto. Al mismo tiempo es deseable una alta proporción de activación por ejemplo, por encima del 94%, lo que deja un intervalo bastante estrecho (por ejemplo, 94-99%) en el que se puede obtener tanto un bajo contenido de degradación como una alta actividad.

[0005] Una cierta cantidad de activación enzimática tendrá lugar simultáneamente durante la purificación de la enzima. Además, los niveles de activación durante el proceso de purificación variarán inevitablemente debido a variaciones en la composición del material de partida - principalmente el título de FVII(a) y por lo tanto la carga de la columna. Un tiempo de retención inesperado durante la purificación también dará lugar a variaciones en los niveles de activación. Durante la purificación, las moléculas de FVII(a) experimentarán diferentes condiciones con respecto a concentración, pH, temperatura y tiempo de residencia, lo que dará lugar a la activación parcial. Se observó que luego de la purificación la proporción de activación varió ampliamente (por ejemplo, de 16% a 74%) dependiendo de la técnica y las condiciones de purificación. Esta variación en la proporción de activación luego de la purificación crea un problema importante con respecto a llevar adelante un proceso de activación estandarizado luego de la purificación.

[0006] La proporción de activación de FVII se puede calcular a través de procedimientos conocidos, sin embargo, no existe actualmente ninguna técnica de medición en tiempo real y los procedimientos conocidos tienen por lo general una duración de aproximadamente 30 minutos. Por consiguiente, si la proporción de activación se aproxima a 99% luego de la extracción de la muestra para la medición, entonces este valor será superado para cuando se obtengan los resultados. Esto resultará en altos niveles de productos de degradación de la cadena pesada indeseables.

[0007] US 4,286,056 (Baxter Travenol Lab) describe un método para producir concentrado del complejo activado de protrombina, que comprende controlar el grado de activación determinando el estado de activación del material de partida y después variando al menos una de las condiciones de activación según los análisis del progreso de la activación del material de partida para llegar a un nivel de activación predeterminado. WO 2007/013993 (Maxygen Holdings Ltd) describe un método para activar FVII a FVII(a) en solución, que comprende agregar un compuesto de amina, Ca2+, ajustar el pH final de la solución entre aproximadamente 7.2 y 8.6, Incubar la mezcla de activación resultante entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 25 °C por un tiempo suficiente para convertir al menos el 90% de scFVII a FVII(a). US 4,456,591 (Baxter Travenol Lab) describe un proceso de administración a un paciente que tiene un defecto en un factor de la coagulación como una deficiencia o un inhibidor, de una cantidad hemostática eficaz de una composición en la que el único agente hemostático eficaz activado es el factor Vll(a).

[0008] Por lo tanto existe una gran necesidad de proporcionar un método mejorado para determinar el tiempo de reacción óptimo a fin de proporcionar los niveles deseados de enzima modificada.

[0009] La invención actual también proporciona un producto más puro de proteasa. Un producto más puro es menos probable que dé lugar a la formación de anti-proteasa (anticuerpos) en el paciente.

[0010] Además, el control estricto de la velocidad de activación de la proteasa se traduce finalmente en menor desperdicio en una planta de producción, puesto que se desecharán menos lotes de producción cuando un mayor número de lotes cumpla con los requisitos especificados en términos de pureza y uniformidad de la calidad.

Resumen de la invención

[0011] Según un aspecto de la invención se proporciona un método de control de la autoactivación del factor Vil, o de un análogo o derivado de éste, que comprende los pasos de:

(a) medir la concentración inicial del factor VIl/VIla, o del análogo o derivado de éste;

(b) medir la proporción inicial del factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste;

(c) calcular el tiempo de reacción de la activación del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, mediante correlación de los valores medidos en cada uno de los pasos (a) y (b) con un valor de la proporción requerida de factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste, donde el tiempo de reacción, t, se calcula según la fórmula (I):

t =

k(T) xb F0

(i)

en la que "a/tf" se refiere a la proporción requerida de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, "a/tfO" se refiere a la proporción inicial de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, medida en el paso (b), "F0" se refiere a la concentración inicial del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, (en g/l) medida en el paso (a), k(T) se refiere a la constante de reacción para la reacción dada (en L/g/min) como una función de la temperatura, T, y xb se refiere a la fracción molar, calculada según la ecuación de la fórmula (III),

i0 PH-1.61

xb ---------------

l + 10^-761

(III)

en la que pH se refiere al pH elegido de la reacción;

(d) realizar, a un pH de 6.0 a 8.0, la reacción de activación del factor Vil durante el tiempo calculado en el paso

(c); y

(e) finalizar la reacción después del tiempo de reacción calculado en el paso (c), finalización que comprende reducir el pH a un valor por debajo de aproximadamente 6.0, como por ejemplo entre 5.5 y 6.0.

[0012] Según otro aspecto de la invención se proporciona un polipéptido que se puede obtener según el método definido antes.

Figuras

[0013]

La figura 1 ilustra el concepto general de la invención. Con aportes variados, el proceso asegura que la producción es esencialmente constante y predecible.

La figura 2 ilustra la importancia de regular estrechamente el grado al cual se activa la proteasa. A medida que el grado de activación (%) aumenta de 99.5% a 100%, el porcentaje de producto degradado (proteasa) aumenta exponencialmente.

La figura 3 ilustra que cuanto más enzima (es decir, proteasa) hay presente en un lote, más rápidamente se producirá la activación de la proteasa. La fracción molar (xb) informada como porcentaje se puede encontrar usando el diagrama de Henderson-Hasselbach. La fracción activa de la enzima se puede calcular para cualquier pH. La correlación no es lineal.

La figura 4 muestra... [Seguir leyendo]

1. Un método para controlar la autoactivación del factor Vil, o de un análogo o derivado de éste, que comprende los pasos de:

(a) medir la concentración inicial del factor VilA/lla, o del análogo o derivado de éste;

(b) medir la proporción inicial del factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste;

(c) calcular el tiempo de reacción de la activación del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, mediante correlación de los valores medidos en cada uno de los pasos (a) y (b) con un valor de la proporción requerida del factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste, donde el tiempo de reacción, t, se calcula según la fórmula (I):

t =

akt0-(aktl) \ akt-(aktO-l) /

k(T) xb F0

(i)

en la que "a/rf" se refiere a la proporción requerida de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, "a/tfO" se refiere a la proporción inicial de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, medida en el paso (b), "F0" se refiere a la concentración inicial del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, (en g/l) medida en el paso (a), k(T) se refiere a la constante de reacción para la reacción dada (en L/g/min) como una función de la temperatura, T, y xb se refiere a la fracción molar, calculada según la ecuación de la fórmula (III),

1 r.pH-7.61

xb --------------------

1 + 1CK"-7'61

(ni)

en la que pH se refiere al pH elegido de la reacción;

(d) realizar, a un pH de 6.0 a 8.0, la reacción de activación del factor Vil durante el tiempo calculado en el paso (c); y

(e) finalizar la reacción después del tiempo de reacción calculado en el paso (c), finalización que comprende reducir el pH a un valor por debajo de aproximadamente 6.0, como por ejemplo entre 5.5 y 6.0.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que k(T) es un polinomio o una spline.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el procedimiento de correlación descrito en el paso (c) se calcula según la fórmula (II):

__i (akt0-{akt-\)\

mWr-(afa0-l)/

k-xb F 0

di)

en la que akt, aktO, k, xb y F0 son los definidos en la reivindicación 1 y k es la constante de reacción.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que k = 0.29.

5. Un método para prevenir la degradación de un factor Vil activado, o de un análogo o derivado del factor Vil activado, donde dicho método comprende los pasos de:

(a) medir la concentración inicial del factor Vil A/l la, o del análogo o derivado de éste;

(b) medir la proporción inicial del factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste;

(c) calcular el tiempo de reacción de la activación del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, mediante correlación de los valores medidos en cada uno de los pasos (a) y (b) con un valor de la proporción

requerida del factor Vil activado, o del análogo o derivado de éste, donde el tiempo de reacción, t, se calcula según la fórmula (I):

t =

k(T) xb F0

en la que "akf se refiere a la proporción requerida de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, "a/tfO" se refiere a la proporción inicial de factor Vil escindido, o del análogo o derivado de éste, medida en el paso (b), "F0" se refiere a la concentración inicial del factor Vil, o del análogo o derivado de éste, (en g/l) medida en el paso (a), k(T) se refiere a la constante de reacción para la reacción dada (en L/g/min) como una función de la temperatura, T, y xb se refiere a la fracción molar, calculada según la ecuación de la fórmula (III),

i npH-7.61

xb -------------

í+io^-7-61

din

en la que pH se refiere al pH elegido de la reacción;

(d) realizar, a un pH de 6.0 a 8.0, la reacción de activación del factor Vil durante el tiempo calculado en el paso (c); y

(e) finalizar la reacción después del tiempo de reacción calculado en el paso (c), finalización que comprende reducir el pH a un valor por debajo de aproximadamente 6.0, como por ejemplo entre 5.5 y 6.0.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el paso (d) se realiza a una temperatura constante.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la temperatura es 5 a 60 °C.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que la temperatura es entre 5 °C y 25 °C.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho análogo del factor Vil es V158D/E296V/M298Q-FVII(a).

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la proporción de escisión requerida estará entre 90 y 99%, como entre 94 y 99%, como entre 95 y 97%, como entre 96 y 98%, como entre 97 y 99%.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la concentración del factor Vll(a), o del análogo o derivado de éste, se ajusta entre 1.5 g/L y 2.2 g/L.

12. Un método como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la reacción de activación se realiza a un pH entre 6.25 y 6.75 (por ej. 6.5 ± 0.05).

13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, en el que la reacción de activación se realiza a temperatura ambiente (porej. 21.5 °C).