Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos.

Compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco representado por la estructura:

**Fórmula**

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

Ab es un anticuerpo;

Y1 es C(O)(C(R10)2)q, (C(R10)2)q o (C(R10)2)qO(C(R10)2)q;

q es 2, 3, 4, 5 o 6,

Y2 es O, NR10, S, OC(O)NR10-(alquil C1-C6)-NR10;

R1 y R2 son independientemente una cadena lateral de aminoácido seleccionada entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(≥NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, - (CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(≥NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo y las estructuras:**Fórmula**

cada R10 se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, carbociclilo C3-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6-C20 y heteroarilo C1-C20, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, I, -CH2OH, -CH2C6H5, -CN, -CF3, -CO2H, -CONH2, -

CONHCH3, -NO2, -N(CH3)2, -NHCOCH3, -NHS(O)2CH3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -S(O)2NH2 y -S(O)2CH3;

n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7; y

p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a conjugados anticuerpo-fármaco con actividad anticancerígena y a sus usos médicos.

Antecedentes de la invención

La terapia de anticuerpos se ha establecido para el tratamiento de fijación de diana de pacientes con cáncer, y trastornos inmunológicos y angiogénicos (Cárter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). El uso de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), es decir inmunoconjugados, para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer, fijan como diana el suministro de restos de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, considerando que la administración sistémica de estos agentes farmacológicos sin conjugar puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales además de para las células tumorales que se busca eliminar (Xie et al. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281 -291; Kovtun ef al. (2006) Cáncer Res. 66(6):3214-3121; Law et al. (2006) Cáncer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al. (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambed J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Trail et al. (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614). De ese modo, se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Los esfuerzos para diseñar y refinar ADC se han centrado en la selectividad de anticuerpos monoclonales (mAb) así como en el mecanismo de acción del fármaco, la unión del fármaco, la proporción fármaco/anticuerpo (carga), y las propiedades de liberación del fármaco (McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.; Doronina et al. (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al. (2006) Cáncer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al. (2005) Clin. Cáncer Res. 11:843- 852; Jeffrey et al. (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al. (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070). Los restos de fármaco puede impartir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN, o unión a topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores proteicos.

Se piensa que el análogo de antraciclina, doxorrubicina (ADRIAMYCIN) interacciona con el ADN por intercalación e inhibición del progreso de la enzima topoisomerasa II, que desenrolla el ADN para la transcripción. La doxorrubicina estabiliza el complejo de topoisomerasa II después de que se rompa la cadena de ADN para la replicación, evitando que se libere la doble hélice de ADN y deteniendo de ese modo el proceso de replicación. La doxorrubicina y daunorrubicina (DAUNOMYCIN) son prototipos de productos naturales citotóxicos de compuestos quimioterapéuticos de antraciclina (Sessa et al. (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7:75-79). Se han preparado y estudiado inmunoconjugados y profármacos de daunorrubicina y doxorrubicina (Kratz ef al. (2006) Current Med. Chem. 13:477- 523; Jeffrey et al. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al. (2005) Bioconj. Chem. 16:717- 721; Nagy et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. 97:829-834; Dubowchik et al. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al. (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; documento de Patente US 6630579). El conjugado anticuerpo-fármaco BR96-doxorrubicina reacciona específicamente con el antígeno asociado a tumor Lewis-Y y se ha evaluado en estudios en fase I y II (Saleh et al. (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al. (2000) Cáncer Jour. 6:78-81; Tolcher et al. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484). Se desvelan análogos de antraciclina y sus conjugados en el documento de Patente US 2007/0060534.

Los análogos de morfolina de doxorrubicina y daunorrubicina, formados por delación del grupo glicósido amino, tienen mayor potencia (Acton et al. (1984) J. Med. Chem. 638-645; documentos de Patente US 4464529; US 4672057; US 5304687). La nemorrubicina es un análogo semisintético de doxorrubicina con un grupo 2- metoximorfolino en el glicósido amino de la doxorrubicina y ha estado en evaluación clínica (Grandi et al. (1990) Cáncer Treat. Rew. 17:133; Ripamonti et al. (1992) Brit. J. Cáncer 65:703;), incluyendo ensayos en fase ll/lll para carcinoma hepatocelular (Sun et al. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cáncer Research, 44:1a Ed, Abs 4649; Pacciarini et al. (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116).

La nemorrubicina se nombra (8S,10S)-6,8,11-trih¡droxi-10-((2R,4S,5S,6S)-5-h¡droxi-4-((S)-2-metox¡morfol¡no)-6- met¡ltetrah¡dro-2H-piran-2-ilox¡)-8-(2-h¡drox¡acet¡l)-1-metoxi-7,8,9,10-tetrah¡drotetraceno-5,12-d¡ona, con N2 Reg. CAS 108852-90-0, y tiene la estructura:

Se han caracterizado varios metabolitos de nemorrubicina (MMDX) a partir de microsomas hepáticos, incluyendo PNU (159682), (Quintieri et al. (2005) Clinical Cáncer Research, 11 (4):1608-1617; Beulz-Riche et al. (2001) 5 Fundamental & Clinical Pharmacology, 15(6):373-378; documentos de Patente EP 0889898; WO 2004/082689; WO 2004/082579). PNU (159682) fue marcadamente más citotóxico que la nemorrubicina y la doxorrubicina in vitro, y fue eficaz en modelos de tumor in vivo. PNU (159682) se nombra 3-desamino-3",4-anhidro-[2"(S)-metoxi-3"(R)-oxi- 4"-morfolinil]doxorrubicina, y tiene la estructura:

Sumario

Los aspectos de la invención incluyen métodos de fabricación, métodos de preparación, métodos de síntesis, 15 métodos de conjugación, y métodos de purificación de los reactivos de resto de fármaco, los reactivos de fármaco- conector, y los compuestos de conjugado anticuerpos-fármaco.

Los compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención comprenden un anticuerpo (Ab) unido covalentemente mediante un conector (L) a uno o más metabolitos de nemorrubicina. Por lo tanto, la presente 20 invención proporciona compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco representados por la estructura:

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que:

Ab es un anticuerpo;

Y1 es C(O)(C(R10)2)q, (C(R10)2)q, o (C(R1°)2)qO(C(R1°)2)q; q es 2, 3, 4, 5 o 6,

Y2 es O, NR10, S, OC(O)NR10-(alquil Ci-C6)-NR10;

R1 y R2 son independientemente una cadena lateral de aminoácido seleccionada entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, - (CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3j -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo, y las estructuras:

cada R10 se selecciona independientemente entre H, alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-Cs, carbociclilo C3-Ci2, heterociclilo C2-C2o, arilo C6-C2o, y heteroarilo Ci-C2o, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, I, -CH2OH, -CH2CeH5, -CN, -CF3, -C02H, -CONH2, - CONHCH3, -N02, -N(CH3)2, -NHCOCHs, -NHS(0)2CH;, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -S(0)2NH2, y -S(0)2CH3; n es 1,2, 3, 4, 5, 6, o 7; y p es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende una mezcla de compuestos anticuerpo-fármaco representados por la estructura anterior, en la que la carga de fármaco promedio por anticuerpo es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye un compuesto de anticuerpo-fármaco representado por la estructura anterior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y que comprende además opcionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método ex vivo de inhibición de proliferación celular que comprende tratar células de mamífero en un medio de cultivo celular con un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, mediante lo cual se inhibe la proliferación de las células.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de anticuerpo-fármaco... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco representado por la estructura:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

Ab es un anticuerpo;

10 Y1 es C(O)(C(R10)2)q, (C(R10)2)q o (C(R1°)2)qO(C(R1°)2)q;

q es 2, 3, 4, 5 o 6,

Y2 es O, NR10, S, OC(O)NR10-(alquil Ci-C6)-NR10;

R1 y R2 son independientemente una cadena lateral de aminoácido seleccionada entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - 15 CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)sNHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -

(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo y las estructuras:

cada R10 se selecciona independientemente entre H, alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-Cs, alquinilo C2-C8, carbociclilo Cs-Ci2, heterociclilo C2-C20, arilo C6-C2o y heteroarilo Ci-C2o, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos 25 seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, I, -CH2OH, -CH2C6H5, -CN, -CF3, -C02H, -CONH2,

CONHCHs, -N02, -N(CHs)2, -NHCOCHs, -NHS(0)2CH3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -S(0)2NH2 y -S(0)2CH3; n es 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7; y p es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

2. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 que tiene la siguiente estructura:

3. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor o receptores de superficie celular seleccionados entre (1)-(36):

(1) BMPR1B (receptor de tipo IB de proteína morfogénica ósea);

(2) E16 (LAT1, SLC7A5);

(3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata);

(4) 0772P (CA125, MUC16);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina);

(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato sódico), miembro 2, transportador de fosfato dependiente de sodio de tipo II 3b);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipol y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B);

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gen RIKEN cDNA 2700050C12);

(9) ETBR (Receptor de endotelina de tipo B);

(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico de potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4);

(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);

(14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs 73792);

(15) CD79b (CD79B, CD79P, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de anclaje afosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);

(17) HER2;

(18) NCA;

(19) MDP;

(20) IL20Ra;

(21) Brevican;

(22) EphB2R;

(23) ASLG659;

(24) PSCA;

(25) GEDA;

(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor BLyS 3, BR3);

(27) CD22 (isoforma del receptor de linfocitos B CD22-B);

(28) CD79a (CD79A, CD79a, asociado a inmunoglobulina alfa);

(29) CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1);

(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno la));

(31) P2X5 (Canal iónico 5 abierto por ligando del receptor purinérgico P2X);

(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2);

(33) LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR));

(34) FcRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fe);

(35) IRTA2 (Receptor 2 asociado a translocación de la superfamilia de inmunoglobulinas); y

(36) TENB2 (proteoglicano transmembrana putativo).

4. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que Ab es un anticuerpo modificado por ingeniería con cisterna.

5. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que Ab es un anticuerpo que se une a un receptor ErbB.

6. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 5 en el que Ab es trastuzumab.

7. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que p es 1,2, 3 o 4.

8. Composición que comprende una mezcla del compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la carga de fármaco promedio por anticuerpo en la mezcla de compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, y opcionalmente es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.

9. Composición farmacéutica que comprende la composición de la reivindicación 8, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un diluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables, y que opcionalmente comprende además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico.

10. Método ex vivo de inhibición de proliferación celular que comprende tratar células de mamífero en un medio de cultivo celular con un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, mediante el cual se inhibe la proliferación de las células.

11. Compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un método de tratamiento de cáncer, comprendiendo el método administrar a un paciente una formulación del compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco.

12. El compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde se administra al paciente un agente quimioterapéutico, en combinación con el compuesto de conjugado anticuerpo- fármaco.

13. Reactivo de fármaco-conector seleccionado entre las estructuras:

en la que:

Y1 es C(O)(C(R10)2)q, (C(R10)2)q, o (C(R1°)2)qO(C(R1°)2)q; q es 2, 3, 4, 5 o 6,

Y2 es O, NR10, S, OC(O)NR10-(alquil Ci-Ce)-NR10;

R1 y R2 son independientemente una cadena lateral de aminoácido seleccionada entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHC0CH3, -

(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH^NHCOCHs, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHC0NH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo y las estructuras:

X

/

H

-0HVY^

10 cada R10 se selecciona independientemente entre H, alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, carbociclilo

C3-C12, heterociclilo C2-C20, arilo C6-C20 y heteroarilo C1-C20, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, I, -CH2OH, -CH2C6H5, -CN, -CF3, -CO2FI, -CONFI2, - CONHCH3, -NO2, -N(CHs)2, -NHCOCH3, -NHS(0)2CHs, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -S(0)2NH2 y -S(0)2CH3; y

15 n es 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7.

14. El reactivo de fármaco-conector de la reivindicación 13 que tiene la siguiente estructura: