Procedimiento para la determinación secuencial de nitrito y nitrato.

Procedimiento para la determinación secuencial de nitrito y nitrato.

Comprende una detección inicial de NO{Sub,2} con reactivo de Griess, seguida por la reducción del NO3 a NO2 con VCl3 y detección posterior del NO2 producido con el exceso de reactivo de Griess presente.

Su límite de detección es< 0.05 μM y proporciona alta precisión en la determinación de NO2 y NO3 para muestras donde la concentración sumada de ambos compuestos sea inferior a 30 μM.

Permite el análisis rápido de series grandes de muestras usando volúmenes pequeños, al reducir a la mitad la cantidad de muestra y de reactivo de Griess utilizados.

Adicionalmente permite diseñar un sistema de análisis mediante inyección de flujo para medir nitrito y nitrato en la misma muestra y el mismo canal, utilizando así la mitad de la cantidad de muestra y reactivo de Griess que emplean los métodos tradicionalmente empleados.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN SECUENCIAL DE NITRITO Y NITRATO.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Química analítica, análisis de nutrientes/compuestos de nitrógeno.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El nitrato es un compuesto clave del ciclo del nitrógeno de los ecosistemas naturales (océanos, estuarios, lagos, etc) y en ambientes artificiales (plantas de tratamiento de aguas residuales, embalses, redes de suministros de agua potable, etc), siendo substrato y producto de varios procesos metabólicos microbianos, vegetales y animales. En sistemas acuáticos, el nitrato se produce por la nitrificación en una reacción de dos pasos: oxidación de amonio a nitrito y oxidación de nitrito a nitrato. El nitrato puede ser asimilado por organismos fotosintéticos, siendo de este modo un nutriente importante en los estudios de producción primaria. El nitrato también es consumido en una variedad de procesos bacterianos tales como desnitrificación o reducción disimilatoria de nitrato a amonio (DNRA). La desnitrificación reduce nitrato a óxido nitroso, un potente gas invernadero (Lashof & Ahuja 1990) o nitrógeno molecular, otro gas, reduciendo la carga de nitrógeno del sistema, mientras que DNRA reduce nitrato a amonio, biológicamente disponible que permanece en el sistema (Megonigal et al. 2003). Por lo tanto, la medida de concentración de nitrito y nitrato en sistemas acuáticos es un aspecto importante de la mayoría de los estudios relacionados con el ciclo del nitrógeno para determinar sus niveles de producción y consumo.

Los nitratos también se usan en actividades humanas, sobre todo como fertilizantes y conservantes alimentarios. Cuando se usan como fertilizantes, la concentración de nitrato en ciertos tipos de cultivos vegetales puede aumentar. Además, el exceso de nitrato es lavado y entra en los sistemas de aguas subterráneas, lagos, o pantanos, contaminando de esta forma los suministros de agua potable. Además, el nitrato en combinación con nitrito se usa con frecuencia como conservante alimentario, en particular en embutidos, y carnes en general. Sabemos que la exposición al nitrato por encima de determinados niveles tiene efectos adversos para los humanos (p.e. aumenta

el riesgo de cáncer para adultos, el síndrome del bebé azul, y metahemoglobinemia infantil) (Greer el al. 2005, Bryan et al. 2012, Bryan et al. 2013, Chan et al. 2013, Martínez et al. 2013), por ello medir su nivel de forma precisa y rápida es esencial.

En la literatura científica hay disponibles numerosos métodos para la determinación del nitrato. Métodos altamente sensitivos se basan en la reducción de nitrato a óxido nítrico, el cuál es determinado por luminiscencia química (Aoki y col. 1997, Braman y Hendrix 1989), o a óxido nitroso pudiendo ser cuantificado por cromatografía de gases (Christensen y Tiedje 1988). Sin embargo, ambas técnicas requieren un equipamiento especializado y caro. Otros métodos implican el uso de ácidos fuertes con frecuencia a temperaturas elevadas (Mir 2008, Zhang y Fischer 2006), lo cual complica el manejo y análisis de las muestras. Por el contrario, el método más simple y comunmente aplicado implica la reducción de nitrato a nitrito y su consecuente medida por colorimetría usando la reacción de Griess (Grasshoff y col. 1983, Marzinzig y col. 1997). El método de basado en la reacción de Griess tiene la ventaja de permitir un límite de detección bajo, alta precisión y una alta especificidad, sin usar instrumentos caros o procedimientos complejos.

El paso crítico de este método para la determinación precisa del nitrato es su reducción eficiente a nitrito. La reducción de nitrato a nitrito se puede conseguir con nitrato reductasas específicas (Guevara y col. 1998, Marzinzig y col. 1997) o por el uso de diferentes metales reductores, siendo el cadmio el más utilizado habitualmente (Grasshoff y col. 1983, Wood y col. 1967). Aunque se han propuesto varias adaptaciones del método de reducción por cadmio para incrementar el número de muestras analizadas por unidad de tiempo, y a la vez reducir el volumen de muestra necesario (Harris y Mortimer 2002, Jones 1984), dicho método tiene varios defectos: es relativamente lento, la eficiencia de la columna de reducción de Cd varía, requiere una continua activación de la columna Cd, y el cadmio es altamente tóxico, haciendo peligroso el manejo de muestras y residuos.

Miranda y col. (2001) describieron un método espectrofotométrico usando una solución de vanadio (VC13) para la reducción de nitrato. El V(III), menos tóxico que el cadmio, ha sido comúnmente usado para la reducción tanto de nitrato como de nitrito a altas temperaturas (80-90°C) para luego medirlo por lumniscencia química (Braman y Hendrix 1989). Miranda y col. (2001) mostraron que a tempertatura ambiente el nitrato se reduce a nitrito, el cuál puede reaccionar con los reactivos de Griess y ser medido

espectrofotometricamente. Sin embargo el protocolo propuesto resulta en una baja absortividad molar para el nitrato, indicando una baja eficiencia en la reacción de la reducción de N03' a N02` Como resultado el nitrito interfiere bastante en la determinación de nitrato. Beda y Nedospasov (2005) incluyeron un paso inicial en el método, eliminando el nitrito en una reacción con ácido sulfámico, reduciendo de esta forma la alta interferencia de N02' en la determinación del N03`. Sin embargo como los siguientes pasos relacionados con la reducción de N03` a N02 no se modificaron, la eficiencia media de la reacción no mejoró. Como resultado, la precisión del método era más baja que usando la clásica columna Cd para la reducción de nitrato.

Bibliografía

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Greer, F. R. , Shannon, M., The Committee on Nutrition, and the Committee on Environmental Health (2005) Infant Methemoglobinemia: The Role of Dietary Nitrate in Food and Water. Pediatrics 116 (3), 784 -786

Bryan, N. S., Alexander, D. D., Coughlin, J.R., Milkowski, A.L., Boffettae, P. (2012) Ingested nitrate and nitrite and stomach cáncer risk: An updated review. Food and Chemical Toxicology 50 (10) 3646-3665

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Martínez, A.; Sanchez-Valverde, F.; Gil, F.; Clerigué, N.; Aznal, E.; Etayo, V.; Vitoria,

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Aoki, T., Fukuda, S., Hosoi, Y. and Mukai, H. (1997) Rapid flow injection analysis method for successive detennination of ammonia, nitrite, and nitrate in water by gas-phase chemiluminescence. Analytica Chimica Acta 349(1-3), 11-16.

Christensen, S. and Tiedje, J.M. (1988) Sub-Parts-Per-Billion Nitrate Method: Use of an N20-Producing Denitrifier to Convert N03- or 15N03- to N20. Applied and environmental microbiology 54(6), 1409-1413.

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Guevara, I., Iwanejko, J., Dembiñska-Kiec, A., Pankiewicz, J., Wanat, A., Anna, P., Gotqbek, I., Bartus, S., Malczewska-Malec, M. and Szczudlik, A. (1998) Determination of nitrite/nitrate in human biological material by the simple Griess reaction. Clínica Chimica Acta 274(2), 177-188.

Wood, E.D., Armstrong, F.A.J. and Richards, F.A. (1967) Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. Journal of the Marine Biological... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación secuencial de nitrito y nitrato, caracterizado porque comprende una fase de detección inicial de N02` con reactivo de Griess, seguido de una segunda fase de reducción del N03' presente en la muestra a N02` con VC13 y la posterior detección del N02' producido con el exceso de reactivo de Griess presente.

2. Procedimiento para la determinación secuencial de nitrito y nitrato, según reivindicación 1, caracterizado porque la primera fase comprende:

Adición de un volumen de reactivo de Griess equivalente a 0,1 veces el volumen de muestra,

Mezcla e incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos, Determinación de la concentración de N02 mediante técnicas espectrofotométricas y curvas de calibrado del estándar de N02\

3. Procedimiento para la determinación secuencial de nitrito y nitrato, según reivindicación 1, caracterizado porque la segunda fase comprende:

Adición de una cantidad de VC13 equivalente a 0.1 veces el volumen del conjunto de la muestra y el reactivo Griess restante en el medio de reacción empleado en la primera fase para reducir el N03' a N02`

Mezcla y posterior incubación a 60 0 C durante 25 minutos

Enfriado a temperatura ambiente

Agitación

Determinación de la concentración del N02' procedente de la reducción de N03` presente y del N02' existente en la muestra, mediante técnicas espectrofotométricas y curvas de calibrado

Determinación de la concentración de N03` mediante el empleo de la siguiente ecuación:

[N03`] = (ABSVnox -ABS reactivos S N02 x[N02-])/

SVN03 (6)

donde

[N03`] es la concentración de nitratos

ABSVnox es la combinación de las absorbancias individuales de cada compuesto (nitrito y nitrato) además de la absorbancia de los reactivos.

ABSvreactivos es la absorbancia de los reactivos en ausencia de N02' y N03" SVno2 es la pendiente de la curva de calibrado de los estándares de N02' SvNo3 es la pendiente de la curva de calibrado de los estándares de N03"

4. Uso del procedimiento descrito en reivindicaciones 1 a 3 para la determinación

de concentraciones de nitrito y nitrato en muestras acuáticas.