Hidrolizado de proteínas rico en tripéptidos.

Un hidrolizado de proteínas en el que al menos 20% molar de los péptidos que tienen un peso molecular de 200 a 2000 Daltons está presente en el hidrolizado como tripéptido y en el cual al menos 30% de los tripéptidos tienen una prolina carboxi-terminal.

Hidrolizado de proteínas rico en tripéptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un hidrolizado de proteínas y los usos del mismo. Antecedentes de la Invención

Existe un interés creciente en el uso de hidrolizados de proteínas para aplicaciones tanto médicas como no-médicas. En ambas aplicaciones, una dieta fácilmente asimilable que ofrezca una absorción gastrointestinal de proteínas facilitada es un factor de importancia primordial. Los hidrolizados de proteínas para aplicaciones médicas requieren también propiedades alergénicas muy reducidas. Para productos destinados a aplicaciones no-médicas, características de sabor agradable y solubilidades satisfactorias en condiciones ácidas son características importantes. Lamentablemente, el proceso de hidrólisis requerido para conseguir estos beneficios lleva consigo varias desventajas. Éstas incluyen sabores residuales amargos, materiales inmunógenos residuales rendimientos bajos de aminoácidos nutricionalmente indispensables, valores osmóticos altos causados por la liberación de aminoácidos libres y, finalmente, estabilidades limitadas en medio ácido.

En publicaciones anteriores se han descrito varias mezclas de enzimas destinadas a optimizar las características del hidrolizado y reducir los costes de producción. Todas estas publicaciones se refieren al uso de endoproteasas simples o mezcladas. Ejemplos incluyen EP321 63, que se refiere al uso de endoproteasas derivadas de animales como tripsina, quimotripsina y pancreatina, así como EP 325 986 y WO 96/13.174, que favorecen el uso de endoproteasas obtenidas de especies Bacillus o Aspergillus. Lamentablemente, estas combinaciones de enzimas producen siempre mezclas de péptidos que son amargas y exhiben una distribución amplia de pesos moleculares. Los péptidos de peso molecular alto son indeseables, dado que son responsables de la respuesta alergénica y su absorción requiere pasos de proceso enzimático adicionales en el intestino. La reducción del sabor residual amargo en los hidrolizados hace indispensable el uso de exoproteasas tales como aminopeptidasas o carboxipeptidasas. Desventajas de este proceso de eliminación del amargor son la liberación de cantidades sustanciales de aminoácidos libres y por tanto sabores caldosos desagradables y pérdidas de aminoácidos nutricionalmente importantes.

En conclusión, la producción industrial de hidrolizados de proteínas sigue estando basada en mezclas de enzimas que están lejos de ser óptimas, por lo que se precisan pasos costosos de purificación para producir mezclas de péptidos que tengan distribuciones de tamaño sub-óptimas.

Después de la absorción dietética normal, las proteínas presentes en los alimentos se hidrolizan gradualmente a fragmentos más pequeños que son transportados finalmente a través de la pared del intestino delgado. Durante el paso a través del tracto gastrointestinal, son activas cierto número de diferentes proteasas que se originan en el estómago, páncreas e intestino delgado. Endoproteasas tales como pepsina, tripsina y quimotripsina escinden las proteínas de peso molecular alto en oligopéptidos más pequeños. Estos oligopéptidos son hidrolizados luego adicionalmente por cierto número de otras enzimas tales como di- y tripeptidil-peptidasas así como amino- y carboxipeptidasas. Los pasos finales de hidrólisis tienen lugar en el intestino delgado y dan como resultado una mezcla de aminoácidos libres y di- y tripéptidos (Grimble, G.K. 1994. Annu.Rev.Nutr. 14; 419-447).

A pesar de la gran colección de proteasas que son activas en el tracto gastrointestinal, es probable que péptidos que resisten a la hidrólisis proteolítica ulterior en el intestino delgado formen una fracción importante de la población superviviente de di- y tripéptidos. Por ejemplo, se ha comunicado que di- y tripéptidos que llevan residuos prolina carboxi-terminales exhiben estabilidades en el cuerpo que son hasta 3 órdenes de magnitud mayores que otros péptidos (Ashmarin, I.P. et al.; Biochemistry (Moscow), Vol 63, No 2,1998, pp119-124). Sistemas portadores específicos para el transporte de los aminoácidos libres o los di- y tripéptidos son responsables del transporte eficiente a través de la pared intestinal. Ha sido identificado un mecanismo independiente de la secuencia peptídica capaz de transportar cantidades cuantitativamente significativas de di- y tripéptidos intactos (Doering, F. et al; 1998; J. Biol. Chem. 273,23211- 23218). Después de entrar en la circulación sanguínea, los péptidos pueden actuar potencialmente como moduladores fisiológicos del metabolismo. Los efectos fisiológicos de los péptidos con actividades opioides, inhibidoras de la ACE, antitrombosis, antiúlcera, antiartrítica y anoréxica han sido descritos (Pihlanto-Leppala, A; Trends in Food Science &Technology 11 (21) 347-356; Ashmarin, I.P. et al.; Biochemistry (Moscow), Vol 63, No 2,1998, pp119-124).

La reciente comercialización de diversos hidrolizados de proteínas que reivindican efectos antihipertensivos pone de manifiesto el alcance incrementado del uso de hidrolizados de proteínas que contienen péptidos "bioactivos" en aplicaciones médicas y no-médicas. Estos péptidos bioactivos e hidrolizados de proteína que contienen tales péptidos bioactivos han sido descritos en numerosas solicitudes de patente. Por ejemplo, WO 97/78 describe hidrolizados obtenidos por incubación con bacterias probióticas o enzimas obtenidas de tales bacterias. WO

99/16.461 describe la inhibición de la enzima convertidora de las angiotensinas portripéptidos específicos obtenidos por fermentación de Lactobacillus. WO 1/32.95 describe la preparación de un producto que contiene péptidos antihipertensivos por fermentación de caseína con bacterias de ácido láctico. Varias otras solicitudes (véase por ejemplo WO 1/68.114) describen el uso de péptidos altamente purificados o sintetizados químicamente para para reducción de la presión sanguínea o tratamiento de diabetes, deterioro renal u obesidad.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un proceso para producir un hidrolizado de proteínas que es rico en tripéptidos en el cual al menos 2% molar de los péptidos tienen un peso molecular de 2 a 2 Da y están presentes como un tripéptido, y en el cual al menos 3% de los tripéptidos tienen una prolina carboxi-terminal. Preferiblemente, el hidrolizado de proteínas de la Invención carece de amargor. El hidrolizado puede comprender opcionalmente dipéptidos.

Conforme a una realización preferida del proceso de la Invención, la proteína o sustrato protelnáceo selecclonada(o) se pone en contacto con una endoproteasa adecuada. Esta endoproteasa adecuada es preferiblemente una endoproteasa especifica de prollna (PSE o EndoPro), utilizándose más preferiblemente una PSE. Además, este sustrato se pone en contacto con una tripeptidasa (TPAP) adecuada o una mezcla de trlpeptldasas. Tales tripeptidasas se definen como enzimas capaces de liberar tripéptidos a partir de un polipéptldo, sea del lado N- terminal del polipéptldo que abarca por tanto las denominadas trlpeptldll-peptidasas, o del lado C-terminal del polipéptido, abarcando así las denominadas peptidll-tripeptidasas. Ventajosamente, el sustrato proteínico se fermenta primeramente con una endoproteasa, tal como una serlna-proteasa, metaloendoproteasa o una proteasa aspártica, para hidrolizar parcialmente la proteína. Se ha encontrado que la TPAP es, en general, más eficaz sobre tales sustratos protefnlcos prehldrollzados.

El proceso conforme a la invención Implica una combinación de una o más endoproteasas con una o más tripeptidasas. Ventajosamente, las enzimas se utilizan en forma aislada y en un intervalo de ratios de proteína tripeptidasa a endoproteasa comprendida entre 1:,5 y 1:5, preferiblemente entre 1:,1 a 1:1.

El sustrato proteínico o el hidrolizado parcial formado puede someterse primeramente a la primera endoproteasa adecuada y subsiguientemente puede añadirse la TPAP o la mezcla de TPAPs. En los casos en que las condiciones de actividad óptimas de las enzimas son aproximadamente idénticas, puede preferirse un proceso en un solo paso. Preferiblemente, la TPAP utilizada en el presente proceso es una TPAP que después de una incubación a pH 5 durante una hora a 5° C exhibe al menos una actividad residual de 7% sobre un sustrato Ala-Ala-X-pNA como se mide en el Ejemplo 1. X puede variar con la TPAP en cuestión dependiendo de la especificidad de la TPAP. X es un residuo de aminoácido que da lugar a al menos una actividad significativa de la TPAP (véase por ejemplo Fig. 1).

Para ser útil como adyuvante de proceso en la preparación de ingredientes alimentarlos, una enzima tiene que cumplir... [Seguir leyendo]

1. Un hidrolizado de proteínas en el que al menos 2% molar de los péptidos que tienen un peso molecular de 2 a 2 Daltons está presente en el hidrolizado como tripéptido y en el cual al menos 3% de los tripéptidos tienen una prolina carboxi-terminal.

2. Un hidrolizado de proteínas conforme a la reivindicación 1, en donde al menos 25% molar, o más preferiblemente al menos 3% molar de los péptidos que tienen un peso molecular de 2 a 2 Daltons está presente en el hidrolizado como tripéptido.

3. Un hidrolizado de proteínas conforme a la reivindicación 1 ó 2, en donde preferiblemente al menos 2%, preferiblemente al menos 3%, o más preferiblemente al menos 4% de la prolina presente en la proteína de partida está presente en los tripéptidos.

4. Un hidrolizado de proteínas conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos 35% de los tripéptidos tienen una prolina carboxi-terminal.

5. Un hidrolizado de proteínas conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos 7% molar de los péptidos, o preferiblemente al menos 75% molar de los péptidos contienen 2 a 7 residuos de aminoácido (dipéptido a heptapéptido).

6. Un método de producción de un hidrolizado de proteínas, comprendiendo el método poner en contacto un sustrato proteínico con:

a) 1 endoproteasa específica de prolina que tiene un pH óptimo ácido; y

b) 1 tripeptidil-aminopeptidasa.

7. Uso del hidrolizado de proteínas conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para consumo por mamíferos, preferiblemente humanos.

8. Una composición enzimática que comprende

a) una endoproteasa específica de prolina que tiene un pH óptimo ácido; y

b) una tripeptidil-aminopeptidasa.

9. Una composición enzimática conforme a la reivindicación 8, en donde la tripeptidil-aminopeptidasa es capaz de escindir detrás de los residuos glutamina/glutamato y asparagina/aspartato.

1. Una composición enzimática conforme a las reivindicaciones 8 ó 9 en donde, cuando esta composición se añade a una proteína adecuada, es capaz de producir un hidrolizado de proteínas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Un producto alimenticio o un pienso que comprende un hidrolizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. El uso de una composición enzimática conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 para reducir la intolerancia a productos alimenticios ricos en prolina.

13. El uso de una composición enzimática conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 en alimentos o piensos o en la producción de alimentos o piensos