HIDROGELES MULTICOMPONENTES BASADOS EN VINILPIRROLIDONA Y SU APLICACIÓN EN INGENIERÍA DE TEJIDOS Y/O MEDICINA REGENERATIVA.

Hidrogeles multicomponentes basados en vinilpirrolidona y su aplicación en ingeniería de tejidos y/o medicina regenerativa.

Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, caracterizado porque comprende: a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero alquénico aniónico o anionizable (A), donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) tienen valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente; y b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el o los entrecruzantes sean i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V); o ii) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V). Procedimiento de obtención del mencionado hidrogel que comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria. Uso del hidrogel en aplicaciones biológicas, biomédicas o biotecnológicas que requieran una interacción no tóxica hidrogel-célula.

HIDROGELES MULTICOMPONENTES BASADOS EN VINILPIRROLIDONA Y SU APLICACIÓN EN INGENIERÍA DE TEJIDOS Y/O MEDICINA REGENERATIVA

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a un hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada que comprende vinilpirrolidona, un monómero alquénico aniónico o anionizable, preferiblemente un monómero acrílico aniónico, y uno o más 10 entrecruzantes. También se refiere a un procedimiento de obtención del hidrogel donde la red multicomponente se forma en una única etapa de polimerización. Adicionalmente, la presente invención también se refiere al uso del hidrogel en ingeniería de tejidos y/o medicina regenerativa, preferiblemente en cultivo celular y transplante de monocapas celulares. 15

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las metodologías tradicionales usadas para el despegado celular implican el uso casi genérico de enzimas proteolíticas agresivas, siendo la más común la tripsina, o métodos de 20 raspado celular. Ambas aproximaciones pueden ser perjudiciales para las células recolectadas. Hay estudios que muestran que el daño causado está asociado a la disrupción de la membrana celular que puede originar una cascada de fallos en la funcionalidad celular. Por ejemplo, se ha descrito que el despegado proteolítico causa alteraciones en la expresión proteómica, concretamente con una mayor expresión de proteínas relacionadas con la 25 apoptosis y una menor expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo y el crecimiento. El despegado mecánico de células causa pérdida de DNA intracelular, da lugar a un bajo número de células y además son células con una matriz de tipo cristalina rodeando las células recuperadas, lo cual es indicativo de fuga intracelular debido a la ruptura de la membrana. [Nash, M. E.; Carroll, W.; Healy, D.; Elvira, C.; Rochev, Y. Journal 30 of Materials Chemistr y 2012, 22, 19376]. Esta disrupción celular constituye una deficiencia muy significativa en estas aproximaciones de desagregado celular, y por tanto existe una búsqueda de métodos alternativos de despegado celular más suaves. A principios de los 90 se desarrollaron plataformas termosensibles capaces de albergar células hasta confluencia y de despegarlas mediante un cambio de la temperatura. Esta aproximación de despegado 35

celular representa un modo más suave y no destructivo de recolección de células que supera las limitaciones de las técnicas tradicionales.

El alto número de publicaciones de las últimas dos décadas dedicadas al desarrollo y optimización de este tipo de plataformas termosensibles habla de la importancia de este 5 campo en biomedicina. La gran mayoría de estas publicaciones describen substratos tipo poli-N-isopropilacrilamida (pNIPAm) , los cuales poseen de forma inherente un comportamiento termosensible en un rango fisiológicamente relevante. A temperaturas por encima de la LCST (lower critical solution temperature) los substratos de pNIPAm asumen un estado hidrofóbico colapsado que bajo ciertas condiciones dan lugar a adhesión y 10 proliferación celular. Algunas de estas condiciones pueden ser bastante estrictas como, por ejemplo, el espesor del sustrato que debe ser muy pequeño. Una vez que el crecimiento celular ha alcanzado el nivel deseado de confluencia, una capa de células puede ser despegada mediante un simple descenso de temperatura por debajo de la LCST. Este descenso convierte el pNIPAm en hidrofílico de forma que la capa polimérica se expande 15 repeliendo la capa celular. Tras este proceso se recolecta la capa celular. La manipulación exitosa de la capa celular requiere el desarrollo de un `superstrato celular, es decir, una membrana superior plana, que se usa para facilitar el recolectado de la capa celular evitando que se doble sobre sí misma e impidiendo su contracción. [Nash, M. E.; Carroll, W.; Healy, D.; Elvira, C.; Rochev, Y. Journal of Materials Chemistr y 2012, 22, 19376]. 20

Las ventajas de despegar células de esta manera, desde un punto de vista biomédico, son fundamentalmente tres. En primer lugar, se ha observado que las células recolectadas de substratos termosensibles mediante modulación térmica retienen su funcionalidad específica y su metabolismo, además no sufren los daños asociados con las técnicas de despegado 25 tradicionales. En segundo lugar, mientras que los métodos clásicos de despegado rinden células individuales o pequeños grupos de células ya que se rompen o separan físicamente las uniones célula-célula, célula-substrato o célula-ECM (proteínas de la matriz extracelular) , los despegados obtenidos usando superficies termosensibles solo afectan a las uniones célula-substrato, manteniendo las uniones célula-célula y célula-ECM. Es por tanto posible 30 despegar una capa celular completa junto al ECM asociado. Las capas de células recolectadas pueden así ser usadas en aplicaciones de ingeniería de tejidos tales como el la reparación de tejido dañado o en la preparación de constructos biomédicos 2D o 3D. Por poner unos pocos ejemplos, esta aproximación de ingeniería de capas celulares ha resultado en la recolección de capas celulares compuestas de células epiteliales de la 35

mucosa oral, epiteliales de la córnea, queratinocitos epidérmicos, mioblastos del tejido esquelético o miocardiocitos. Además, capas celulares se han superpuesto para conseguir sistemas 3D similares a tejidos, usando una o más tipos de células y manteniendo su integridad fisiológica y morfológica. [Nagase, K.; Kobayashi, J.; Okano, T. The Royal Society Society, Interface 2009, 3, 293]. Las capas celulares obtenidas de este modo se han 5 propuesto para muchas aplicaciones clínicas, como miocardiopatía dilatada, cirugía plástica reconstructiva y regenerativa, ulceración del esófago y oftalmología. El trasplante de capas celulares autólogas recolectadas de pNIPAm a pacientes humanos ha sido descrito recientemente. Estas terapias de capas celulares se han usado en el trasplante de capas celulares epiteliales de mucosa oral a córneas para evitar la opacificación corneal del 10 paciente y mantener transparencia de la córnea, así como en el trasplante de capas celulares de mioblastos autólogos en multicapas para tratar miocardiopatía dilatada en un paciente, enfermedad coronaria habitual. En el primer estudio el trasplante sin sutura se restableció la transparencia óptica en los 4 pacientes tratados y en el segundo se mejoró significativamente la función cardiaca del paciente. Ya que esta aproximación empleó 15 células autólogas se evitaron los problemas de rechazo inmunológico presentes en otras terapias alternativas. Es importante resaltar que se deben realizar otros ensayos clínicos antes de que estas terapias puedan ser ampliamente adoptadas. [Kobayashi, J.; Okano, T. Science and Technology of Advanced Materials 2010, 11, 1. Sawa, Y.; Miyagawa, S.; Sakaguchi, T.; Fujita, T.; Matsuyama, A.; Saito, A.; Shimizu, T.; Okano, T. Surger y Today 20 2012].

Por último, los requisitos clínicos en ingeniería de tejidos han sufrido un desplazamiento colectivo hacia la adopción de prácticas en cultivo celular que eviten el uso de productos derivados de animales tales como tripsina debido al riesgo asociado con la exposición 25 involuntaria a patógenos inesperados presentes en la fuente animal. Por tanto, un despegado de células que no use productos derivados de animales cumpliría los requerimientos de seguridad en aquellos cultivos celulares en los que las células van a ser usadas en aplicaciones clínicas/terapéuticas.

El hecho de que tales substratos estén ahora disponibles en el mercado a nivel mundial apoya los esfuerzos dedicados al desarrollo de este tipo de plataformas, aunque el alto coste de los substratos disponibles comercialmente hace su uso prohibitivo como material de rutina en cultivo celular. [Nash, M. E.; Carroll, W.; Healy, D.; Elvira, C.; Rochev, Y. Journal of Materials Chemistr y 2012, 22, 19376]. Ya que los substratos puros de pNIPAm 35

son pobres soportes celulares, se han desarrollado diversas técnicas para producir recubrimientos en base pNIPAm que propicien bioadhesión. Hay que destacar la polimerización mediante haz electrónico de NIPAm para formar una capa ultra-fina de pNIPAm que se ha descrito como apropiada para el crecimiento celular para un amplio rango de líneas celulares. Si el recubrimiento de pNIPAm supera los ~30nm de espesor el 5 recubrimiento se considera biorepulsivo, es decir, pocas células se unen y proliferan. [Nagase, K.; Kobayashi, J.; Okano, T. The Royal Society Society, Interface 2009, 3, 293. Kobayashi, J.; Okano, T. Science and Technology of Advanced Materials 2010, 11, 1]. Otras técnicas para producir recubrimientos de pNIPAm describen correlaciones similares entre el espesor y la adhesión celular... [Seguir leyendo]

1. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada, caracterizado porque comprende:

a) unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) y unidades derivadas de un monómero 5 alquénico aniónico o anionizable (A) , donde las relaciones de reactividad en copolimerización radical binaria de (V) y (A) tienen unos valores máximo y mínimo de 0.5 respectivamente; y b) unidades derivadas de al menos un entrecruzante; siempre que el o los entrecruzantes sean: 10

i) dos entrecruzantes E1 y E2, donde E1 presenta homología al menos parcial respecto a (A) y E2 presenta homología al menos parcial respecto a (V) ; o ii) un entrecruzante E3 que presenta homología respecto a (A) y (V) .

2. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según la 15 reivindicación 1, donde (A) se selecciona del grupo que consiste en monómero acrílico y monómero estirénico, comprendiendo en ambos casos al menos un grupo aniónico o anionizable.

3. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una 20 cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el grupo aniónico o anionizable de (A) es sulfonato o un grupo sulfónico anionizable.

4. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según la reivindicación 3, donde (A) es una sal alcalina o amónica de metacrilato de C1-C10-25 alquilsulfonato.

5. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende unidades derivadas de vinilpirrolidona (V) , unidades derivadas de un monómero acrílico aniónico (A) , unidades 30 derivadas de un entrecruzante E1 con homología al menos parcial respecto a (A) y unidades derivadas de un entrecruzante E2 con homología al menos parcial respecto a (V) .

6. Hidrogel con estructura de redes poliméricas entrecruzadas interconectadas según la reivindicación 5, donde E1 es un oxi-, oxi-amino- o amino-derivado de un precursor con dos 35

o más alcoholes y/o aminas primarias o secundarias, en los que al menos dos de dichos alcoholes o aminas han sido derivatizados a acrílicos para formar el entrecruzante E1.

7. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, donde E2 es un oxi-, oxi-amino-, carboxi- o amino-5 derivado de un precursor con dos o más alcoholes, uno o más alcoholes y una o más aminas primarias o secundarias, dos o más ácidos, o dos o más aminas primarias o secundarias; en los que al menos dos de dichos alcoholes, al menos un alcohol y una amina, al menos dos ácidos, o al menos dos aminas han sido derivatizados a vinílicos para formar el entrecruzante E2. 10

8. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde E3 corresponde a un compuesto de fórmula:

E3

donde 15

X1 se selecciona del grupo que consiste en O y NH;

R14 se selecciona del grupo que consiste en H y CH3; y R13 es alquilo C1-C10 lineal o ramificado.

9. Procedimiento de obtención del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 8, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto los monómeros (A) y (V) con los entrecruzantes E1 y E2, o el entrecruzante E3, en condiciones de polimerización radicalaria.

10. Procedimiento de obtención del hidrogel según la reivindicación 9, que comprende 25 añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de monómero alquénico aniónico o anionizable (A) y vinilpirrolidona (V) tal que la relación molar entre ellos es 0.001 [A]/[V] 2.

11. Procedimiento de obtención del hidrogel según la reivindicación 10, que comprende 30 añadir al medio de polimerización una cantidad inicial de entrecruzante E1 entre 0.1-100%

molar respecto a la cantidad inicial de monómero (A) ; y una cantidad inicial de entrecruzante E2 entre 0.001-10% molar respecto a la cantidad inicial de vinilpirrolidona.

12. Hidrogel con estructura de red polimérica multicomponente entrecruzada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, obtenido por el procedimiento tal como se describe 5 en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Producto que comprende el hidrogel tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o en la reivindicación 12.

14. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, o del material tal como se describe en la reivindicación 13 para cultivo celular in vitro.

15. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, para fabricar un soporte para transplante celular in vivo. 15

16. Uso del hidrogel tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 12, para fabricar un producto para actuar como sistema de barrera en el tratamiento de heridas.