Formulaciones antagonistas de VEGF.

Una formulación líquida de un antagonista de VEGF, que comprende histidina 10 mM,

NaCl 50 mM, sacarosa al 5-20 %, y 50-100 mg/ml de una proteína de fusión que tiene un componente del receptor que consiste en un dominio similar a la inmunoglobulina (Ig) 2 de un primer receptor de VEGF y un dominio de Ig 3 de un segundo receptor de VEGF, y un componente de multimerización, a un pH de 6,0-6,5, donde el primer receptor de VEGF es Flt1 y el segundo receptor de VEGF es Flk1 o Flt4, que además comprende polisorbato 20 al 0,1 % o PEG 3350 al 3 %.

Formulaciones antagonistas de VEGF Campo de la invención

La presente invención se dirige a formulaciones farmacéuticas que comprenden agentes capaces de inhibir al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). La invención incluye formulaciones farmacéuticas que tienen estabilidad aumentada.

Estado de la técnica relacionada

La expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es prácticamente ubicua en cáncer humano, en consistencia con su papel como un mediador clave de la neoangiogénesis tumoral. El bloqueo de la función de VEGF, mediante la unión a la molécula o su receptor VEGFR-2, inhibe el crecimiento de las células tumorales implantadas en múltiples modelos de xenotrasplantes (véase, por ejemplo, Gerber et al. (2000) Cáncer Res. 60:6253-6258). Se ha descrito una proteína de fusión antagonista soluble específica de VEGF, denominada una "Trampa de VEGF" (Kim et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 99: 11399-404; Holash et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:11393-8).

Los siguientes documentos también se refieren a:

- El documento WO 2005/000895 que se refiere a las Trampas de VEGF y a los usos terapéuticos de las mismas;

- Fraser et al (2005) J. Clin. Endocrinol. & Metabolism, 90(2): 1114-1122 que concierne a inyecciones simples de una trampa de factor de crecimiento endotelial vascular que bloquea la ovulación;

- El documento US 2005/032699 que concierne a una composición de un antagonista de VEGF y un agente anti-prollferativo;

- El documento WO 02/060489 que concierne a un método para usar una variante del receptor de VEGF para tratar la psoriasis y para potenciar la curación de heridas; y

- El documento US 2005/276808 que concierne a un método de administración y de uso de los inhibidores de VEGF para el tratamiento del cáncer.

Breve sumario de la invención

En el presente documento se proporcionan formulaciones estables de una proteína de fusión específica antagonista de VEGF. Las formulaciones farmacéuticamente aceptables de la invención comprenden la "trampa" antagonista de VEGF con un transportador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona una formulación líquida de una proteína de fusión antagonista específica de VEGF, que comprende histidina 10 mM, NaCI 50 mM, sacarosa al 5-20 % y 50-100 mg/ml de una proteína de fusión que tiene un componente del receptor que consiste en un dominio similar a inmunoglobulina (Ig) 2 de un primer receptor de VEGF y un dominio de Ig 3 de un segundo receptor de VEGF, y un componente de multimerización, a un pH de 6,0-6,5, en el que el primer receptor de VEGF es Flt1 y el segundo receptor de VEGF es Flk1 o Flt4, que además comprende polisorbato 20 al 0,1 % o PEG 3350 al 3 %.

En una realización, la proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°:4.

La proteína de fusión puede comprender los aminoácidos de 62-457 de SEC ID: N°4 y está glucosilada en los restos de Asn 62, 94, 149, 222 y 308.

Descripción detallada de la Invención

Descripción general

El manejo seguro y la administración de las formulaciones que comprenden proteínas representan retos significativos para los formuladores farmacéuticos. Las proteínas poseen propiedades químicas y físicas únicas que presentan problemas de estabilidad: existe una variedad de rutas de degradación para las proteínas, implicando tanto la Inestabilidad química como la física. La inestabilidad química incluye la desaminación, agregación, el recorte de la estructura peptídica y la oxidación de los restos de metionina. La inestabilidad física abarca muchos fenómenos, Incluyendo, por ejemplo, la agregación.

Antagonistas del VEGF

Un antagonista de VEGF es un compuesto que puede bloquear o Inhibir la acción biológica del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), e Incluye proteínas de fusión capaces de atrapar a VEGF. En una realización preferente, el antagonista de VEGF usado en la formulación de la Invención es la proteína de fusión de SEC ID N°:4. El

antagonista de VEGF puede expresarse en una línea celular de mamíferos tal como una célula CHO y puede modificarse post-traduccionalmente. En una realización específica, la proteína de fusión comprende los aminoácidos de 27-457 de SEC ID N°:4 y está glucosilada en los restos de Asn 62, 94, 149, 222 y 308.

El antagonista de VEGF puede prepararse por cualquier método conocido en la materia o que será conocido.

El antagonista de VEGF está preferentemente sustancialmente libre de proteínas contaminantes en el momento en el que se usa para preparar la formulación farmacéuticamente aceptable. Por "sustancialmente libre de proteínas contaminantes" se entiende, preferentemente, que al menos el 90 % del peso de la preparación proteína de fusión antagonista específica de VEGF usada para realizar una formulación es una proteína de fusión antagonista de VEGF, más preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 %, La proteína de fusión está preferentemente sustancialmente libre de agregados. "Sustancialmente libre de agregados" significa que al menos el 90 % del peso de la proteína de fusión no está presente en un agregado en el momento en el que la proteína de fusión se usa para preparar la formulación farmacéuticamente eficaz. La proteína de fusión puede contener cantidades bajas o traza de compuestos como resultado del proceso de purificación, por ejemplo, cantidades bajas o traza de citrato y/o polisorbato.

Formulaciones líquidas estables

La invención proporciona una formulación líquida estable farmacéuticamente aceptable tal como se define anteriormente.

Se determina la estabilidad de una serie de modos en momentos especificados, incluyendo la determinación del pH, la inspección visual del color y la apariencia, la determinación del contenido de proteína total por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, espectroscopia UV, SDS-PAGE, HPLC de exclusión molecular, bloensayo de la determinación de la actividad, isoelectroenfoque y cuantificación de isoaspartato. En un ejemplo de bloensayo útil para determinar la actividad del antagonista de la actividad de VEGF, se usa una línea celular BAF/3 VEGFR1/EPOR para determinar la unión a VEGF165.

Pueden almacenarse las formulaciones en un ambiente privado de oxígeno. Los ambientes privados de oxígeno pueden generarse mediante el almacenamiento de las formulaciones con un gas inerte tal como por ejemplo, argón, nitrógeno o helio.

Ejemplos

Ejemplo 1. Estabilidad de una Formulación Líquida de una Trampa de VEGF a 50 mg/ml

Una formulación líquida que contiene fosfato 10 mM, NaCI 50 mM, polisorbato 20 al 0,1 %, sacarosa al 20% y 50 mg/ml de trampa de VEGF (SEC ID N°:4), pH 6,25, se almacenó a 5 °C y se ensayaron las muestras a los 3, 6, 9, 12, 18 y 24 meses. Se determinó la estabilidad mediante SE-HPLC. Los resultados, mostrados en la Tabla 1, muestran que el 98,6 % y el 98,3 % de la proteína de la trampa de VEGF permanecía Intacta (no degradada) a los 12 y 24 meses, respectivamente. La turbidez se midió a una DO405 nm, y el porcentaje de proteína recuperada por HPLC de exclusión molecular.

Tabla 1. Estabilidad de la Proteína de la Trampa de VEGF a 50 mg/ml Cuando se Almacena a 5 °C

Una formulación líquida que contenía fosfato 10 mM, NaCI 50 mM, PEG 3350 al 3 %, sacarosa al 20 % y 50 mg/ml de trampa de VEGF (SEC ID N°:4), pH 6,25, se almacenó a 5 °C y se ensayaron las muestras... [Seguir leyendo]

1. Una formulación líquida de un antagonista de VEGF, que comprende histidina 10 mM, NaCI 50 mM, sacarosa al 5-20 %, y 50-100 mg/ml de una protema de fusión que tiene un componente del receptor que consiste en un dominio

5 similar a la inmunoglobulina (Ig) 2 de un primer receptor de VEGF y un dominio de Ig 3 de un segundo receptor de VEGF, y un componente de multimerización, a un pH de 6,0-6,5, donde el primer receptor de VEGF es Flt1 y el segundo receptor de VEGF es Flk1 o Flt4, que además comprende polisorbato 20 al 0,1 % o PEG 3350 al 3 %.

2. La formulación liquida de la reivindicación 1, donde la protema de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de 10 SEC ID N°:4.

3. La formulación líquida de la reivindicación 1 o 2, donde la proteína de fusión comprende los aminoácidos de 27-457 de SEC ID N°:4 y está glucosilada en los restos de Asn 62, 94, 149, 222 y 308.