Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos.

Un proceso para preparar un antisuero de un animal no humano, que comprende los pasos de:

(i) administrar al animal no humano una hemaglutinina de virus de la gripe purificada; y después

(ii) recuperar del animal no humano suero que contiene anticuerpos que reconocen la hemaglutinina, caracterizado porque la hemaglutinina usada en el paso (i) es de un virus cultivado en una línea celular mamífera.

Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos

Descripción CAMPO TECNICO

Esta invención está en el campo de la fabricación de vacunas para proteger contra el virus de la gripe.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA

El proceso actual para preparar vacunas estacionales contra infección de virus de gripe humana implica los pasos siguientes [1, 2]: (a) aislamiento de cepas de virus circulantes; (b) análisis antigénico y genético de los virus aislados; (c) selección de cepas de siembra para su uso durante la próxima estación; (d) preparación de cepas de siembra de alto crecimiento por redistribución o el uso de genéticas inversas; (e) lanzamiento de cepas de siembra para los fabricantes de vacunas; (f) evaluación por los fabricantes de la idoneidad de la cepa para la producción industrial; y (g) cultivo de las cepas de siembra para producir virus de los que se fabrican las vacunas.

Los pasos (a) a (e) de este proceso se realizan por la FDA y centros para la gripe internacionales aprobados por el gobierno, típicamente bajo el patronazgo de la Organización Mundial de la Salud; los pasos (f) y (g) se realizan por los mismo fabricantes.

El paso (d) transiciona un virus de uno que está adaptado de forma natural para infectar humanos a uno que crecerá a títulos altos bajo condiciones de crecimiento industriales. Para el virus de la gripe A, este paso implica típicamente crear una cepa redistribuida 6:2 que incluye los segmentos de genoma que codifican Ha-y Na-para las cepas seleccionadas en (c) y los seis segmentos del genoma restantes de una cepa que crece eficientemente en huevos de gallina, y esta cepa es habitualmente la A/PR/8/34. El procedimiento de redistribución es seguido después por el paso repetido de la cepa en huevos embrionados para permitir la adaptación del huevo y la mejora del crecimiento. Para el virus de la gripe B, se obtienen cepas prototipo con buenas características de crecimiento por paso directo y repetido en huevos embrionados sin intentar generar redistribuciones.

Así los pasos realizados antes del lanzamiento a los fabricantes de vacunas implican pasar virus de la gripe por huevos. Incluso si los virus se cultivan por un fabricante en el paso (g) en un sustrato celular, en lugar de en huevos, el virus todavía habrá pasado a través de huevos en alguna etapa entre el aislamiento en el paso (a) y la recepción por un fabricante en el paso (e) .

Por ejemplo, el paso (a) implica exponer un sustrato a una muestra del paciente, de tal manera que cualquier virus en la muestra infectará el sustrato. El sustrato puede entonces amplificar la cantidad de virus presente, y los virus amplificados están después disponibles para estudio adicional. Este paso puede tener lugar en huevos o en células mamíferas. Las células conocidas para su uso en aislamiento primario incluyen células MRC-5 [3], células Vero [4, 5], células MDCK [6], células HepG2 [7], células LLC-MK2 [8], etc. En general, sin embargo, los huevos de gallina continúan siendo usados para aislar cepas de referencia para la fabricación de vacunas contra la gripe. El uso de huevos es tan importante para los procedimientos actuales que en la estación 2003-04 la FDA rechazó el uso de la cepa H3N2 (A/Fujian/411/2002) más apropiada ya que no había sido aislada originalmente en huevos [2, 9] y no había disponibles cepas aisladas en huevos antigénicamente similares.

Se ha propuesto anteriormente eliminar el uso de huevos de varias etapas de la fabricación del virus de la gripe.

La referencia 10 propone que las vacunas deberían ser cultivadas en cultivo celular usando o una (i) cepa de alto crecimiento de un aislado clínico pasado o (ii) un redistribuido derivado de al menos una cepa del virus de la gripe mamífera de origen natural, siempre que el aislado o redistribuido no se haya pasado por huevos de ave. Así el proceso descrito en la referencia 10 empieza con un virus de siembra que ya ha sido seleccionado o manipulado para el crecimiento en el cultivo celular de elección.

La referencia 11 compara virus pasados a través de huevos con los pasados a través de células MDCK, pero selecciona específicamente los primeros para la fabricación de vacunas.

La referencia 12 sugiere que los virus de siembra para vacunas contra gripes pandémicas podrían prepararse propagando la cepa pandémica directamente en cultivo celular mamífero en lugar de a través de huevos embrionados, pero indica que el paso por el huevo era obligatorio para la fabricación inter-pandémica. La razón para este paso por el huevo obligatorio es que se ha creído que actúa como un "filtro" para agentes extraños: las agencias reguladoras han aceptado que un serie de pasos en un sistema aviar, entre el asilado clínico original de un humano y la vacuna final para la administración a humanos, evitará que se co-repliquen agentes extraños de tipo mamífero con el virus de la gripe.

La invención tiene por objeto proporcionar procedimientos adicionales útiles en la fabricación de vacunas contra la gripe, en los que se reduce el uso de huevos, y preferiblemente se evita del todo. En un aspecto particular, la invención tiene por objeto proporcionar procedimientos adicionales y mejorados útiles en el aislamiento del virus de la gripe.

DIVULGACION DE LA INVENCION

Aunque se ha propuesto anteriormente eliminar el uso de huevos de varias etapas de la fabricación de virus de la gripe, la invención difiere de estas propuestas en varios aspectos.

Enlace de Receptores

Los virus de la gripe humana enlazan con los oligosacáridos receptores que tienen un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal (ácido siálico 2, 6 enlazado con galactosa) , pero los huevos en cambio tienen oligosacáridos receptores con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal. El cultivo de virus de la gripe humana en huevos proporciona presión de selección en hemaglutinina lejos del enlace Sia (2, 6) Gal hacia el enlace Sia (2, 3) Gal Como los huevos, las células Vero expresan predominantemente receptores Sia (2, 3) Gal [15]. Por el contrario las células MDCK y las células PER.C6 expresan ambas Sia (2, 3) Gal y Sia (2, 6) Gal. La referencia 16 informa de la transfección de células MDCK para sobre-expresar -2, 6-sialiltransferasa para favorecer la selección del enlace Sia (2, 6) Gal. Incluso sin dichas manipulaciones, sin embargo, es posible cultivar virus de la gripe en células MDCK sin desplazarlas hacia el enlace Sia (2, 3) Gal. Por lo tanto la invención puede usar células que expresan tanto Sia (2, 3) Gal como Sia (2, 6) Gal, pero puede producir virus de la gripe que tienen una preferencia de enlace para oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal En realizaciones preferidas del primer y segundo aspectos de la invención, los virus de la gripe usados para la infección en el paso (i) tienen una preferencia de enlace para oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal. Esta preferencia de enlace se mantiene durante el paso (ii) y el paso (iii) , de tal manera que el virus de la gripe producido en el paso (iii) tiene una preferencia para oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal.

En realizaciones preferidas del tercer y cuarto aspectos de la invención, los virus de la gripe usados para la infección en el paso (ii) tienen una preferencia de enlace para oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal. Esta preferencia de enlace se mantiene durante el paso (iii) y el paso (iv) , de tal manera que el virus de la gripe producido en el paso (iv) tiene una preferencia de enlace para oligosacárido con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal.

Para determinar si un virus tiene una preferencia de enlace para oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 6) Gal terminal en comparación con oligosacáridos con un disacárido Sia (2, 3) Gal terminal se pueden usar varios ensayos. Por ejemplo, la referencia 13 describe un ensayo ligado a enzimas en fase sólida para la actividad de enlace el receptor del virus de la gripe que da mediciones de sensibilidad y cuantitativas de las constantes de afinidad. La referencia 14 usó un ensayo en fase sólida en el que se evaluó el enlace de los virus de dos sialilglicoproteinas (ovomucoide, con determinantes Sia (2, 3) Gal; y 2-macroglobulina de cerdo, con determinantes Sia (2, 6) Gal) , y también describe un ensayo en el que el enlace... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para preparar un antisuero de un animal no humano, que comprende los pasos de: 5 (i) administrar al animal no humano una hemaglutinina de virus de la gripe purificada; y después (ii) recuperar del animal no humano suero que contiene anticuerpos que reconocen la hemaglutinina, caracterizado porque la hemaglutinina usada en el paso (i) es de un virus cultivado en una línea celular mamífera.

2. Un proceso para preparar un antisuero de un animal no humano, que comprende los pasos de:

(i) cultivar virus de la gripe en una línea celular mamífera;

(ii) purificar el antígeno de hemaglutinina del virus cultivado en el paso (i) ;

(iii) administrar la hemaglutinina purificada del paso (ii) al animal no humano; y después 15 (iv) recuperar del animal no humano suero que contiene anticuerpos que reconocen la hemaglutinina.

3. El proceso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el animal no humano es una oveja.

4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la hemaglutinina está libre de materiales derivados de huevo.

5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye el paso adicional de mezclar el antisuero con un gel adecuado para un ensayo SRID.

6. El proceso de la reivindicación 1 en donde la hemaglutinina usado en el paso (i) es de un virus que no se ha cultivado nunca en huevos.

7. El proceso de la reivindicación 1 en donde la hemaglutinina usada para desarrollar el antisuero es glicosilada con glicanos obtenibles del cultivo en una línea celular mamífera.

8. Un proceso para preparar un kit, que comprende los pasos de (i) hacer un antisuero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4; (ii) hacer un material de referencia del antígeno por un proceso que comprende los pasos de

(a) cultivar virus de la gripe en una línea celular; (b) purificar virus cultivados en el paso (a) ; y (c) inactivar los virus, caracterizado porque el virus de la gripe usado en el paso (a) no se ha cultivado nunca en huevos; y (iii) combinar 35 los productos de los pasos (i) y (ii) en un kit.

9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde la línea celular es una línea celular MDCK.

10. El proceso de la reivindicación 9 en donde la línea celular MDCK es la MDCK33016.