Expresión de una proteína mitocondrial mediante un enfoque alotópico mejorado.

Un vector de expresión adaptado al suministro eficiente y estable de una proteína al interior de la mitocondria de una célula de mamífero,

en el que dicho vector comprende:

- una secuencia de ácido nucleico de direccionamiento a la mitocondria (secuencia de ácido nucleico MTS),

- una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína según el código genético universal (secuencia CDS), y

- una secuencia de ácido nucleico 3', que está ubicada en 3' de dicha secuencia de ácido nucleico MTS y de dicha CDS,

en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS es:

- la secuencia de ADNc de una MTS de un ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, o

- un fragmento conservativo de dicha secuencia de ADNc, que se deriva de ésta mediante deleción de uno o varios nucleótidos, pero ha conservado una función de direccionamiento a la mitocondria,

en el que dicha secuencia de ácido nucleico 3' es:

- la secuencia de ADNc de la secuencia 3'UTR de un ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, o

- un fragmento conservativo de dicha secuencia de ADNc, que se deriva de ésta mediante deleción de uno o varios nucleótidos y que, cuando sustituye a la 3'UTR de tipo silvestre de dicho ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, sigue permitiendo el direccionamiento mitocondrial del ARNm resultante,

en el que dicha CDS es un ácido nucleico que codifica una proteína mitocondrial y

en el que dicho vector no comprende ninguna secuencia que sería idéntica a:

- la 3'UTR de un ARNm de origen natural que es un ARNm transcrito en el núcleo pero no dirigido a la mitocondria, o - la secuencia de ADNc de dicha secuencia 3'UTR, o

- una secuencia de ADN transcrita en dicha 3'UTR de ARNm de origen natural,

con lo que dicho vector no usa una vía de importación postraduccional, sino que usa una vía de importación por cotraducción desde el núcleo hasta dicha mitocondria.

Expresión de una proteína mitocondrial mediante un enfoque alotópico mejorado 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN:

[1] La presente invención se refiere al campo de la biología celular, la genética molecular y la medicina. La presente invención se refiere, más particularmente, a la importación de proteínas al interior de la mitocondria de células animales y humanas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

[2] Las mitocondrias ocupan una posición central en el metabolismo global de células eucariotas; por lo tanto la fosforilación oxidativa (OXPHOS), el ciclo de Krebs, el ciclo de la urea, la biosíntesis del grupo hemo y la

oxidación de ácidos grasos tienen lugar dentro del orgánulo. Recientemente, se estableció otro papel fundamental para las mitocondrias en la determinación del periodo de vida celular, dado que se ha reconocido que son un mediador temprano fundamental en la cascada apoptótica. Las mitocondrias también son un productor fundamental de especias reactivas de oxígeno (ROS) que causan estrés oxidativo y, por lo tanto, inductoras de muerte celular.

Los defectos primarios en la función mitocondrial están implicados en más de 12 enfermedades y la lista sigue creciendo, éstas abarcan una extraordinaria colección de problemas clínicos, que habitualmente implican tejidos que tienen elevados requisitos energéticos, tales como la retina, el corazón, el músculo, el riñón, el páncreas y el hígado. Su incidencia se estima en 1 de cada 5. nacimientos vivos. De hecho, la combinación de datos epidemiológicos en enfermedades mitocondriales infantiles y adultas sugiere esta prevalencia como mínima, y podría ser mucho 25 mayor. Por lo tanto, las patologías mitocondriales están consideradas entre las enfermedades determinadas genéticamente más comunes, y son un problema de salud fundamental dado que siguen siendo inaccesibles a terapias tanto curativas como paliativas.

La mitocondria está ensamblada con proteínas codificadas por genes distribuidos entre los genomas mitocondrial y 3 nuclear. Estos genes incluyen los que codifican las proteínas estructurales de los complejos l-V de la cadena respiratoria, sus sustratos y productos asociados, las proteínas necesarias para la biogénesis mitocondrial, el aparato para importar precursores sintetizados en el citoplasma y las proteínas necesarias para el ensamblaje y la renovación mitocondrial. Los estudios que conducen a la identificación de genes implicados en trastornos mitocondriales han realizado avances considerables en la última década. De hecho, se han descrito numerosas 35 mutaciones tanto en ADN mitocondrial como en una serie de genes nucleares relacionadas con una llamativa diversidad de cuadros clínicos.

Aproximadamente la mitad de los trastornos mitocondriales humanos son causados por mutaciones puntuales patógenas del ADNmt, un tercio de las cuales están ubicadas en genes codificantes. Actualmente no existe ningún 4 tratamiento para ninguno de estos trastornos, un posible enfoque terapéutico es introducir en el núcleo una copia de tipo silvestre del gen mutado en el genoma mitocondrial e importar copias normales del producto génico en las mitocondrias desde el citosol. Este enfoque se ha denominado "expresión alotópica".

Ya ha habido algunos informes que describen que la versión localizada en el núcleo manipulada de algunos genes

del ADNmt podía expresarse en células de mamífero. Por ejemplo, en un caso de enfermedad de Leigh, se

construyó un plásmido en el que la señal de direccionamiento mitocondrial del gen COX8 codificado en el núcleo se añadió a un gen ATP6 mitocondrial recodificado, mutado en pacientes. Células transfectadas de forma estable de pacientes presentan una mejora del crecimiento en medio con galactosa y un incremento leve de la síntesis de ATP, sin embargo la cantidad de proteína Atp6 importada en las mitocondrias era relativamente baja (18,5%), lo que 5 implicaba que el precursor no era importado de forma eficiente (Manfredi, G., et al., Rescue of a deficiency in ATP synthesis by transfer of MTATP6, a mitochondrial DNA-encoded gene to the nucleus. Nature Genet., 22. 3: p. 394-399).

Oco-Cassio y colaboradores han demostrado que la expresión alotópica de apocitocromo b y ND4 en células Cos-7

y HeLa, no causaba una importación mitocondrial eficiente de estas proteínas (Oca-Cossio, J., et al., Limitations of

allotopic expression of mitochondrial genes in mammalian cells. Genetics, 23. 165: p. 77-72).

Por lo tanto, hoy en día aún se encuentran importantes limitaciones a la expresión alotópica como enfoque terapéutico y requieren optimización para superar las significativas trabas antes de que ésta pueda ser aplicada en

terapia genética.

Una hipótesis que puede explicar la mala capacidad de importación de la proteína mitocondrial es su elevada hidrofobicidad. Por lo tanto, el precursor sintetizado en el citoplasma se queda pegado a la membrana mitocondrial 5 externa.

El ensamblaje de las mitocondrias depende de la síntesis equilibrada de 13 proteínas codificadas por el ADNmt con más de otras mil codificadas por el ADN nuclear. Dado que la gran mayoría de los pollpéptldos mltocondrlales se sintetizan en el citoplasma, existe el requisito de un sistema de direccionamiento de proteínas eficiente y específico. 1 Este proceso implica el transporte de ARNm desde el núcleo hasta la superficie de las mitocondrias.

Los inventores examinaron la posibilidad de que la expresión alotópica de ADN tal como ADNmt pudiera optimizarse mediante una localización dirigida del ARNm en la superficie mitocondrial.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN:

[3] Las proteínas mitocondriales son codificadas por ácidos nucleicos que están ubicados en la mitocondria, es decir ácidos nucleicos mitocondriales (ADNmt, ARNmt), así como por ácidos nucleicos que se originan a partir del núcleo, es decir ácidos nucleicos nucleares (ADNn, ARNn).

[4] Los inventores describen un enfoque alotópico mejorado para importación de proteínas al interior de la mitocondria. La presente invención proporciona medios, incluyendo composiciones, que permiten la importación mitocondrial con una eficiencia y estabilidad mejoradas en comparación con técnicas de la técnica anterior. Los medios de la invención permiten una localización dirigida del ARNm en la superficie mitocondrial.

En comparación con técnicas de la técnica anterior, los medios de la invención permiten la importación eficiente y estable de una proteína al interior de la mitocondria de un animal o ser humano que la necesita, tal como un animal o ser humano que tiene una disfunción celular causada por una o varias mutaciones en un gen que codifica una proteína mitocondrial.

[5] Los inventores demuestran que la distribución de ARNm en la superficie mitocondrial es una manera eficiente de proceder a dicha expresión alotópica, y que esta distribución de ARNm puede controlarse seleccionando una secuencia de direccionamiento a la mitocondria (MTS) apropiada y secuencias 3'UTR apropiadas. La secuencia CDS que codifica la proteína a suministrar al interior de la mitocondria es guiada por estas secuencias MTS y 3'UTR apropiadas desde el compartimento nuclear a los polisomas unidos a la mitocondria (donde la CDS se traduce), y 35 ayuda a una eficiente translocación de una proteína funcional madura al interior de las mitocondrias.

[6] Los inventores demuestran que, para obtener una importación terapéuticamente eficaz estable,

preferentemente deben usarse tanto una MTS apropiada como una 3'UTR apropiada.

[7] Las secuencias MTS y 3'UTR apropiadas corresponden a las de ARNm transcritos en el núcleo y

dirigidos a mitocondrias. Si se usa un vector, se prefiere que éste no contenga ninguna 3'UTR que correspondería a la 3'UTR de ARNm transcritos en el núcleo pero no dirigidos a mitocondrias. Al mejor saber y entender de los inventores, todos los vectores disponibles en el mercado contienen dicho ARNm no dirigido a mitocondrias; se prefiere entonces borrar esta 3'UTR inapropiada del vector antes de usarlo como importador mitocondrial.

[8] Los medios de la invención están especialmente adaptados a células animales y humanas y, más

particularmente, a células de mamífero. Estos proporcionan acceso a medios terapéuticamente eficaces para dichas células.

[9] La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS:

[1]

Figuras 1A y 1 B: Mapa y secuencia de COX1 MTS- nATP6, SOD2MTS-nATP6, COX1 MTS- nATP6 COX1 3'UTR, SOD2MTS- nATP6- SOD2 3'UTR obtenidos en el vector pCMV-Tag 4A.

Figura 1A. Las cuatro construcciones se representan esquemáticamente.

Figura... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión adaptado al suministro eficiente y estable de una proteína al interior de la

mitocondria de una célula de mamífero,

en el que dicho vector comprende:

- una secuencia de ácido nucleico de direccionamiento a la mitocondria (secuencia de ácido nucleico MTS),

- una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína según el código genético universal (secuencia CDS), y 1 - una secuencia de ácido nucleico 3, que está ubicada en 3' de dicha secuencia de ácido nucleico MTS y de dicha

CDS,

en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS es:

- la secuencia de ADNc de una MTS de un ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, o

- un fragmento conservativo de dicha secuencia de ADNc, que se deriva de ésta mediante deleción de uno o varios nucleótidos, pero ha conservado una función de direccionamiento a la mitocondria,

en el que dicha secuencia de ácido nucleico 3 es:

- la secuencia de ADNc de la secuencia 3UTR de un ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, o

- un fragmento conservativo de dicha secuencia de ADNc, que se deriva de ésta mediante deleción de uno o varios nucleótidos y que, cuando sustituye a la 3UTR de tipo silvestre de dicho ARNm codificado en el núcleo y dirigido a la mitocondria, sigue permitiendo el direccionamiento mitocondrial del ARNm resultante,

en el que dicha CDS es un ácido nucleico que codifica una proteína mitocondrial y 25

en el que dicho vector no comprende ninguna secuencia que sería idéntica a:

- la 3UTR de un ARNm de origen natural que es un ARNm transcrito en el núcleo pero no dirigido a la mitocondria, o

- la secuencia de ADNc de dicha secuencia 3UTR, o

- una secuencia de ADN transcrita en dicha 3UTR de ARNm de origen natural,

con lo que dicho vector no usa una vía de importación postraduccional, sino que usa una vía de importación por co- traducción desde el núcleo hasta dicha mitocondria.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS es la

secuencia de ácido nucleico MTS de SOD2, o de COX 1, o de AC2, o de ATP5b, o de UQCRFS1, o de NDUFV1, o de NDUFV2 o de ALDH2.

3. El vector de expresión de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS 4 codifica una secuencia de la SEQ ID NO: 34, o la SEQ ID NO: 46, o la SEQ ID NO: 32, o la SEQ ID NO: 36, o la

SEQ ID NO: 38, o la SEQ ID NO: 4, o la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 44.

4. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS es la SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 3.

5. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha secuencia de ácido nucleico 3 es:

- la secuencia 3UTR de SOD2, o de COX1, o de AC2, o de ATP5b, o de UQCRFS1, o de NDUFV1, o de 5 NDUFV2, o de ALDH2 o de AK2, o

- la secuencia de ADNc de dicha secuencia 3UTR, o

- una secuencia de ADN que codifica dicha secuencia 3UTR según el código genético universal.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia de ácido nucleico 3 es la SEQ 55 ID NO: 35, o la SEQ ID NO: 47, o la SEQ ID NO: 33, o la SEQ ID NO: 37, o la SEQ ID NO: 39, o la SEQ ID NO: 41, o

la SEQ ID NO: 43, o la SEQ ID NO: 45 o la SEQ ID NO: 57.

7. El vector de expresión de la reivindicación 5 ó 6, en el que dicha secuencia de ácido nucleico 3 es la SEQ ID NO: 35 o la SEQ ID NO: 47.

8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha secuencia de ácido nucleico

MTS es la secuencia de ácido nucleico MTS de SOD2, y dicha secuencia 3' UTR es la secuencia 3' UTR de SOD2.

9. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha secuencia de ácido nucleico

MTS es la secuencia de ácido nucleico MTS de COX1, y dicha secuencia 3' UTR es la secuencia 3' UTR de COX1.

1. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicha secuencia CDS 1 es la secuencia de un ácido nucleico mitocondrial de origen natural, recodificada según el código genético universal.

11. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia CDS es una secuencia de ácido nucleico de ATP6, o de ND1, o de ND4, recodificada según el código genético universal.

12. El vector de expresión de la reivindicación 11, en el que dicha secuencia CDS es la secuencia de

ácido nucleico de la SEQ ID NO: 29 (ND4 recodificado), la SEQ ID NO: 28 (ND1 recodificado) o la SEQ ID NO: 27 (ATP6 recodificado).

13. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende al menos una secuencia de 2 la SEQ ID NO: 25 (MTS de COX1 - ND1 recodificado - 3UTR de COX1), la SEQ ID NO: 26 (MTS de COX1 -

ND4 recodificado - 3UTR de COX1), la SEQ ID NO: 21 (MTS la COX1 - ATP6 recodificado - 3UTR de COX1), SEQ ID NO: 22 (MTS de SOD2 - ATP6 recodificado - 3UTR de SOD2).

14. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 y 9-11, en el que dicho vector es un virus 25 adenoasociado (VAA), en el que dicha secuencia de ácido nucleico MTS es la secuencia de ácido nucleico MTS de

COX1, dicha secuencia 3' UTR es la secuencia 3' UTR de COX1, y dicha secuencia CDS es una secuencia de ácido nucleico de ND4 recodificada según el código genético universal.

15. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicha secuencia CDS 3 es la secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico nuclear de origen natural que codifica una proteína

mitocondrial funcional.

16. El vector de expresión de la reivindicación 15, en el que dicho ácido nucleico nuclear de origen natural es ARNm transcrito en el núcleo y dirigido a la mltocondrla, o la secuencia de ADN de dicho ARNm.

17. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana.

18. Una célula de mamífero manipulada que comprende al menos un vector según una cualquiera de las 4 reivindicaciones 1-17.

19. Una composición farmacéutica que comprende al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o al menos una célula de mamífero manipulada según la reivindicación 18.

2. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento terapéutico, paliativo y/o preventivo de una

mlopatía, o de una neuropatía óptica en la que dicha composición comprende al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o al menos una célula de mamífero manipulada según la reivindicación 18.

21. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento terapéutico, paliativo y/o preventivo de una

neuropatía óptica según la reivindicación 2, en el que dicha neuropatía óptica es NOHL, AOD, NEBF, SLHM o NARP.