Ensayo de inmunodifusión para el virus de la gripe.

Un procedimiento para realizar un ensayo de inmunodifusión que comprende al menos las siguientes etapas de:

(a) preparar una o más muestras de ensayo que comprenden un antígeno del virus de la gripe,

(b) tratar las muestras de ensayo con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(c) aplicar las muestras tratadas a un gel que contiene un anticuerpo específico del antígeno del virus de gripe y

(d) dejar que las muestras se difundan en el gel.

Ensayo de inmunodifusión para el virus de la gripe Campo técnicoLa invención se refiere al campo de los ensayos realizados en preparaciones de virus y composiciones de vacuna, tales como composiciones que comprenden el virus de la gripe. En particular, la invención se refiere a la determinación de la concentración de antígeno en dichas preparaciones o composiciones, en particular, en forma de preparaciones y composiciones con adyuvante, tales como vacunas.

Antecedentes de la técnica Los virus de la gripe son uno de los virus más ubicuos presentes en el mundo, que afecta tanto a los seres humanos como al ganado. La gripe da como resultado una carga económica, morbilidad e incluso mortalidad significativas. Los virus de la gripe causan epidemias casi todos los inviernos, con tasas de infección por virus de hasta el 40 % en un periodo de seis semanas. La infección de la gripe tiene como resultado varios estados patológicos, desde una infección subclínica, pasando por una infección leve de las vías respiratorias superiores hasta una neumonía viral grave. Las epidemias de gripe típicas causan aumentos en la incidencia de neumonía y de enfermedades de las vías respiratorias inferiores como lo demuestra el aumento de las tasas de hospitalización o mortalidad.

La vacunación juega un papel fundamental en el control de las epidemias anuales de gripe. Actualmente las vacunas antigripales disponibles están inactivadas o son vacunas vivas atenuadas del virus de la gripe.

Si bien la gran mayoría de las vacunas antigripales actuales, para la gripe estacional, son vacunas sin adyuvante, otros enfoques, como para las vacunas pandémicas dependen de la adyuvación para poder ser capaces de disminuir el contenido de antígeno (ahorro de antígeno) y aumentar así el número de dosis de vacuna disponibles. El uso de un adyuvante también puede ser útil para superar la potencial inmunogenicidad débil del antígeno en sujetos específicos, tales como en una población de individuos no tratados previamente o inmuno-comprometidos. A modo de ejemplos, se pueden citar los virus de la gripe con adyuvante de sal de aluminio, tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, o con emulsión de aceite en agua. Está comercializada una vacuna antigripal de tipo subunidad con adyuvante con la emulsión de aceite en agua MF59.

Un ensayo clásico para estandarizar el contenido de antígeno de las vacunas antigripales es el ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID) (J.M. Wood y col.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330) , que fue recomendado por la OMS en 1978 para sustituir a las pruebas basadas en la aglutinación de los eritrocitos. El ensayo se basa en la inmunodifusión de los antígenos del virus de la gripe, tales como el antígeno hemaglutinina (HA) , en un gel de agarosa que contiene suero anti-HA específico, durante el cual se formarán complejos antígeno-anticuerpo dentro del gel. El antígeno HA se difunde radialmente desde los pocillos y reacciona con anticuerpos específicos, produciendo una zona de opalescencia en el gel, generalmente en forma de un anillo. El área de la zona de reacción que rodea los pocillos que contienen antígeno es una estimación de la cantidad de antígeno añadido al pocillo. Tras la tinción del gel, se mide la superficie de estos anillos y el contenido de antígeno de una preparación de virus de un cierto subtipo se calcula utilizando una curva de calibración obtenida con un lote de referencia de antígeno de este subtipo con un contenido en HA conocido.

Sin embargo, un ensayo de este tipo puede no ser adecuado para cualquier tipo de preparaciones o composiciones del virus de la gripe, en particular, para las preparaciones con adyuvante, ya que la presencia de adyuvante puede interferir con la prueba normal.

Por lo tanto, hay una necesidad de proporcionar mejoras en el ensayo SRID con el fin de ampliar su aplicabilidad y, en particular, para que sea adecuado para las preparaciones o composiciones con adyuvantes, tales como vacunas con adyuvante.

El documento WO 2009/081172 desvela un protocolo modificado de ensayo SRID para la gripe para un antígeno adsorbido en adyuvante, en particular, para las vacunas con adyuvante de sal de aluminio, que incluye una etapa adicional en la que el antígeno se desorbe del adyuvante antes de la difusión.

Por lo tanto, todavía hay una necesidad de proporcionar un ensayo SRID modificado, en particular, adecuado para la evaluación de vacunas con adyuvante, que sea fácil y rápido de poner en práctica y aplicable para identificar y/o cuantificar antígenos, tales como HA, en cualquier tipo de preparación de virus, ya sea con adyuvante o no, incluyendo formulaciones de vacuna final.

Sumario de la invención Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para realizar un ensayo de inmunodifusión que comprende al menos las siguientes etapas de:

(a) preparar una o más muestras de ensayo que comprenden un antígeno del virus de la gripe,

(b) tratar las muestras de ensayo con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(c) aplicar las muestras tratadas a un gel que contiene un anticuerpo específico del antígeno del virus de gripe y

(d) dejar que las muestras se difundan en el gel.

En un segundo aspecto, se proporciona un procedimiento para cuantificar la concentración de HA de una vacuna que comprende un antígeno del virus de la gripe que comprende al menos las siguientes etapas de:

(i) tratar la vacuna, o una muestra de la misma, con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(ii) tratar las muestras de referencia que comprenden un antígeno del virus de la gripe de una concentración conocida con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(iii) aplicar la vacuna tratada, o una muestra de la misma, y las muestras de referencia tratadas a un gel que contiene un anticuerpo específico del antígeno del virus de la gripe,

(iv) permitir que las muestras se difundan en el gel,

(v) determinar una dimensión de los anillos de precipitación en el gel formados por la vacuna, o una muestra de la misma, y una dimensión de los anillos de precipitación formados por las muestras de referencia, y

(vi) comparar entre sí las dimensiones determinadas en la etapa (v) y usar los resultados de la comparación para calcular la concentración de HA en la vacuna, o en una muestra de la misma, aplicada en la etapa (iii) .

Descripción detallada La presente invención se refiere a un procedimiento de inmunodifusión para la identificación de un antígeno de interés, tal como un antígeno viral y/o la determinación de la concentración del antígeno de interés dentro de una preparación o una composición, tal como una vacuna. En particular, el procedimiento de la invención proporciona un ensayo SRID modificado que no sólo es adecuado para preparaciones de virus sin adyuvante, sino especialmente también para preparaciones con adyuvante, en particular, vacunas de la gripe con adyuvante emulsión de aceite en agua.

Los inventores, sorprendentemente, han observado que un adyuvante, en particular, una emulsión de aceite en agua, cuando está presente en una muestra que comprende un antígeno viral, tal como un antígeno del virus la gripe, tiene un impacto significativo en la difusión del antígeno durante el ensayo SRID. El anillo de difusión resultante es de un tipo inusual. De hecho, cuando se compara con muestras sin adyuvante, las muestras que comprenden un adyuvante, cuando se procesan en un ensayo SRID, daban como resultado un anillo de difusión cuyo aspecto era mucho más oscuro y más difuso, haciendo que la delimitación fuese más borrosa. Se dieron cuenta de que un aspecto tan diferente de los anillos tenía un impacto en los resultados de cuantificación de antígenos obtenidos con el ensayo SRID. Observaron que, en presencia del adyuvante, los resultados mostraban una gran variabilidad y una concentración de antígeno más baja, en comparación con los resultados obtenidos con composiciones similares que no tenían adyuvante. Por lo tanto, el uso del ensayo SRID clásico utilizado en la técnica para evaluar el contenido de HA de las muestras con adyuvante que comprenden un antígeno del virus de la gripe conduce a una medición errónea de ese contenido, ya que este queda subestimado. Tanto la variabilidad del... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para realizar un ensayo de inmunodifusión que comprende al menos las siguientes etapas de:

(a) preparar una o más muestras de ensayo que comprenden un antígeno del virus de la gripe,

(b) tratar las muestras de ensayo con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(c) aplicar las muestras tratadas a un gel que contiene un anticuerpo específico del antígeno del virus de gripe y

(d) dejar que las muestras se difundan en el gel.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de (e) determinar una dimensión de los anillos de precipitación formados en el gel por las muestras de ensayo tratadas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que las muestras de referencia que comprenden un antígeno del virus de la gripe de una concentración conocida se preparan y se tratan en las mismas condiciones que las muestras de ensayo y se aplican de manera similar al gel.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antígeno del virus de la gripe es hemaglutinina (HA) .

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, que comprende la etapa adicional (f) de determinar una dimensión de los anillos de precipitación en el gel formados por las muestras de referencia tratadas.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende la etapa adicional de (g) comparar la dimensión determinada en la etapa (e) con la dimensión determinada en la etapa (f) y utilizando los resultados de la comparación, calcular la concentración de antígeno en la muestra de ensayo aplicada en la etapa (c) .

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de ensayo es una vacuna antigripal inactivada.

8. Un procedimiento para cuantificar la concentración de HA de una vacuna que comprende un antígeno del virus de la gripe que comprende al menos las siguientes etapas de:

(i) tratar la vacuna, o una muestra de la misma, con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(ii) tratar las muestras de referencia que comprenden un antígeno del virus de la gripe de una concentración conocida con al menos 10 % (p/v) de un detergente zwitteriónico,

(iii) aplicar la vacuna tratada, o una muestra de la misma, y las muestras de referencia tratadas a un gel que contiene un anticuerpo específico del antígeno del virus de la gripe,

(iv) permitir que las muestras se difundan en el gel,

(v) determinar una dimensión de los anillos de precipitación en el gel formados por la vacuna, o una muestra de la misma, y una dimensión de los anillos de precipitación formados por las muestras de referencia, y

(vi) comparar entre sí las dimensiones determinadas en la etapa (v) y usar los resultados de la comparación para calcular la concentración de HA en la vacuna, o en una muestra de la misma, aplicada en la etapa (iii) .

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de detergente (b) , o las etapas de detergente (i) y (ii) se implementan en ausencia de cualquier sal añadida exógenamente.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las muestras de ensayo, o la vacuna, y las muestras de referencia comprenden un adyuvante.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el adyuvante comprende al menos una emulsión de aceite en agua.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la emulsión de aceite en agua comprende escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80.

13. El uso del procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, para el control de la estabilidad de una muestra de ensayo, o de una vacuna.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el contenido de antígeno del virus de la gripe dentro de la muestra de ensayo, o el contenido de HA en la vacuna, se cuantifica después de que la muestra de ensayo, o la vacuna, se ha almacenado durante un periodo de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: 7 días, 14 días, 30 días, 1 mes, 6 meses, 12 meses y 18 meses a la temperatura seleccionada del grupo que consiste en: 4 ºC, temperatura ambiente, 30 ºC y 37 ºC.