Derivados metanosulfonilaminoindol y sondas oligonucleótidas marcadas que los contienen.

Compuesto que presenta la fórmula:**Fórmula**

caracterizado por que:

A y B son independientes uno de otro e independientes de R y X, y en la que A y B se seleccionan de entre el grupo que consiste de:

(1) hidrógeno,

(2) un grupo protector,

(3) una fase sólida con un conector,

(4) una fosforamidita,

(5) un H-fosfonato,

(6) un trifosfato,

(7) un fosfato, y

(8) una cadena de residuos nucleótidos,

con la condición de que A pero no B sea un trifosfato,

con la condición de que, en el caso de que A o B sea una fosforamidita o un H-fosfonato, el otro de A y B es un grupo protector y R no es OH,

con la condición de que únicamente uno de entre A y B es una fase sólida con un conector,

y en la que:

R≥H, OH, O-alquilo, O-alquenilo, O-alquinilo, O-grupo protector o F,

X es un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido o un conector con un grupo reactivo o un conector con un grupo reactivo protegido o una entidad de señal o una entidad de señal protegida o un conector con una entidad de señal o un conector con una entidad de señal protegida.

Derivados metanosulfonilaminoindol y sondas oligonucleótidas marcadas que los contienen Campo de la invención

La presente invención reafirma los nucleósidos indol sustituidos como bloques constructivos terminales y también internos de sondas oligonucleótidas marcadas para la detección, análisis y cuantificación de ácidos nucleicos. El sustituyente comprende un conector y un grupo detectable o un conector y un grupo reactivo para el mareaje posterior a la síntesis. Dichos nucleósidos modificados proporcionan acceso a un amplio campo de aplicación. Estos nuevos nucleósidos indol sustituidos pueden utilizarse como reactivos de mareaje para la preparación sencilla de, por ejemplo, sondas de hibridación optimizadas, sondas Taqman o sondas de baliza molecular.

Antecedentes tecnológicos

El incremento constante del número de secuencias genómicas descodificadas y mapeadas de flora y fauna es una demostración impresionante de la importancia actual de las técnicas del ADN. Sin embargo, lo importante no es la mera secuenciación del ADN. Con el incremento del conocimiento en el campo de la genómica y la proteómlca, crece el interés científico en el impacto de efectos específicos, por ejemplo mutaciones, sobre el futuro de células u organismos. Por una parte, debido a que los ácidos nucleicos con frecuencia se encuentran presentes en concentraciones muy bajas y, por otra, con frecuencia se encuentran en presencia de muchas otras sustancias sólidas y/o disueltas, por ejemplo tras la lisis de células, resultan difíciles de aislar o de medir.

Se han establecido diversos métodos para la detección, análisis y cuantificación mediante hibridación del ácido nucleico diana con una sonda detectable (por ejemplo la hibridación Southern, la transferencia por puntos, los ensayos en gel o la PCR).

La herramienta principal del trabajo relacionado con los ácidos nucleicos, por ejemplo para la amplificación de ácidos nucleicos poliméricos, es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En los últimos años ha crecido notablemente nuestro conocimiento y las aplicaciones de la PCR.

Un procedimiento de PCR consiste en general de tres etapas: la preparación de muestras, la amplificación y el análisis del producto. Aunque estas etapas habitualmente se llevan a cabo secuencialmente, la amplificación y el análisis pueden realizarse simultáneamente. Pueden añadirse pigmentos de ADN o sondas fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y utilizarse para analizar los productos de PCR durante la amplificación. La amplificción y análisis concurrentes de la muestra dentro del mismo tubo sin variar el instrumento reduce el tiempo de manipulación de las muestras y minimiza el riesgo de contaminación del producto para las reacciones posteriores. Este enfoque de combinación de amplificación y análisis se conoce como PCR "en tiempo real" (patente US n° 6.174.670).

Otras reacciones de amplificación posibles son la reacción en cadena de la ligasa (LCR, Wu D.Y. y Wallace R.B., Genomics 4:560-569, 1989; Barany F., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:189-193, 1991; patente US n° 5.494.810), la reacción en cadena de la polimerasa-ligasa (Barany F., PCR Methods Appl. 1:5-16, 1991); Gap-LCR (documento n° WO 90/01069, patente US n° 6.004.286); reacción de reparación de cadena (patente n° EP 0 439 182 A2); 3SR (Kwoh D.Y. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989; Guatelli J.C. et al., Proc. Nati. Acad. Sel. USA 87:1874-1878, 1990; documento n° WO 92/08808) y NASBA (patente US n° 5.130.238). Además, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, patentes US n° 5.270.184 y n° 5.455.166), la amplificación mediada por transcripción (TMA) y la amplificación Q-beta (para una revisión, ver, por ejemplo, Whelen A.C. y Perslng D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50:349-373, 1996; Abramson R.D. y Myers T.W., Curr. Opin. Blotechnol. 4:41-47, 1993), así como la amplificación de ácidos nucleicos isotérmica y quimérica iniciada por cebador (ICAN, Shimada M. et al., Rinsho Byori. 51:1061-1067, 2003) y la amplificación en cascada por círculo rodante (CROA, Thomas D.C. et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 123:1170-1176, 1999).

Para la técnica de ácidos nucleicos anteriormente indicada resultan necesarios (desoxi)-oligonucleótidos sintéticos que han sido dotados de un mareaje detectable, por ejemplo para llevar a cabo un amplio espectro de diversos métodos biológicos moleculares y diagnósticos moleculares.

Se conocen de la técnica métodos para la síntesis de secuencias de oligonucleótidos de cadena sencilla y de análogos de oligonucleótidos (por ejemplo Oligonucleotide Synthesis: A Practlcal Approach, Galt, ed., IRL Press, Oxford, 1984; Kuijpers W.H.A., et al., Nucleic Acids Research 18:5197-5205, 1990; Dueholm K.L., J. Org. Chem. 59:5767-5773, 1994; Agrawal S. (ed.), Methods in Molecular Biology, volumen 20).

El primer método eficaz y ampliamente aplicable para la síntesis de oligonucleótidos y polinucleótidos fue el método de fosfotriéster (ver, por ejemplo, Letsinger R.L. et al., J. Am. Chem. Soc. 91:3360-3365, 1969). Para evitar reacciones secundarias tales como la ramificación durante la síntesis, se han protegido los grupos reactivos con, por

ejemplo, el grupo beta-cianoetilo o el grupo ortoclorofenilo. Como activador para la etapa de acoplamiento se ha utilizando cloruro de mesitil-sulfonilo y mesltil-sulfonil-nitrotriazol.

Habitualmente se preparan (desoxi-)ollgonucleótidos sintéticos en una fase sólida con ayuda de reacciones de fosforamidita. Como fase sólida habitualmente se preparan perlas de vidrio que presentan poros de un tamaño definido (abreviadas a continuación como VPC=vidrio de poro controlado). El primer monómero se une al soporte mediante un grupo escindióle de manera que el oligonucleótido puede liberarse mediante el corte de dicho grupo tras completar la síntesis en fase sólida. El primer monómero adicionalmente contiene un grupo hidroxilo protegido, mientras que habitualmente se utiliza dimetoxitritilo (DMTr) como el grupo protector. El grupo protector puede eliminarse mediante tratamiento ácido. A continuación, los derivados 3-fosforamidita de (desoxl-)hbonucleótldos también dotados de un grupo protector DMTr se acoplan en un procedimiento cíclico a cada grupo reactivo sucesivo tras liberarlo del grupo protector DMTr.

Según la técnica anterior pueden utilizarse materiales de soporte trifuncionales para preparar ollgonucleótldos que se marcan en el extremo 3'. Para ello, se proporciona un espaciador trifuncional con dos grupos hidroxilo reactivos y un grupo reactivo adicional, preferentemente un grupo amino. El mareaje detectable se une al grupo amlno reactivo del espaciado trifuncional. Sin embargo, alternativamente el mareaje detectable no sólo se acopla al espaciador trifuncional mediante un grupo amino reactivo sino también mediante un tercer grupo hidroxilo o un grupo SH (patente US n° 5.451.463, documento n° WO 92/11388). En una tercera etapa, el espaciador trifuncional se une mediante su grupo hidroxilo que todavía se encuentra libre al grupo de unión del material de fase sólida que ha sido dotado de un enlace escindible.

Alternativamente, el mareaje detectable no se acopla hasta la síntesis misma de oligonucleótldos (patente US n° 5.141.837). Sin embargo, debido a que lo anterior requiere múltiples reacciones independientes de acoplamiento, dicho procedimiento de producción resulta laborioso, costoso y no puede automatizarse.

Las fosforamiditas marcadas en las que se une el grupo marcador a la fosforamidita mediante un conectar C3-C12 habitualmente se utilizan para sintetizar oligonucleótidos marcados en el extremo 5'.

Por lo tanto, también pueden introducirse mareajes detectables internamente mediante la estrategia de fosforamiditas (Wojczewski C. et al., Synlett. 10:1667-1678, 1999). Pueden utilizarse los mismos espaciadores trifuncionales para lo anterior, así como para la síntesis de materiales de CPG. En lugar de unir uno de los grupos hidroxilo a la fase sólida, dicho grupo hidroxilo se convierte en una fosforamidita en dicho procedimiento. La fosforamidita resultante puede utilizarse para la síntesis de oligonucleótidos como una amidita estándar. En principio, dichas fosforamiditas también pueden utilizarse para el mareaje interno mediante la sustitución de una fosforamidita de nucleósido estándar por una fosforamidita marcada con fluoróforo durante el ciclo de síntesis. Sin embargo, preferentemente se utiliza para el mareaje 5' debido a que el mareaje interno interrumpe el apareamiento de bases en la cadena.

Los oligonucleótidos dotados de un mareaje fluorescente, tal como fluoresceína, con frecuencia se utilizan en biología molecular, tal como para la medición... [Seguir leyendo]

1. Compuesto que presenta la fórmula:

caracterizado por que:

A y B son independientes uno de otro e independientes de R y X, y en la que A y B se seleccionan de entre el grupo que consiste de:

(1) hidrógeno,

(2) un grupo protector,

(3) una fase sólida con un conector,

(4) una fosforamidita,

(5) un H-fosfonato,

(6) un trifosfato,

(7) un fosfato, y

(8) una cadena de residuos nucleótidos,

con la condición de que A pero no B sea un trifosfato,

con la condición de que, en el caso de que A o B sea una fosforamidita o un H-fosfonato, el otro de Ay B es un grupo protector y R no es OH,

con la condición de que únicamente uno de entre A y B es una fase sólida con un conector, y en la que:

R=H, OH, O-alquilo, O-alquenilo, O-alquinilo, O-grupo protector o F,

X es un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido o un conector con un grupo reactivo o un conector con un grupo reactivo protegido o una entidad de señal o una entidad de señal protegida o un conector con una entidad de señal o un conector con una entidad de señal protegida.

2. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado por que X es un grupo reactivo, un grupo reactivo

protegido, un grupo conector, un grupo conector protegido o una entidad de señal.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que R=H.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que B es un grupo

fosforamidato, un H-fosfonato o un VPC y A es un grupo protector.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que A es un grupo

fosforamidato, un H-fosfonato o un VPC y B es un grupo protector.

6. Oligonucleótido que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Oligonucleótido según la reivindicación 6, caracterizado por que dicho oligonucleótido comprende por lo menos dos compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado por que dicho oligonucleótido comprende por lo menos dos entidades de señal.

9. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que dicha entidad de señal es una entidad fluorescente.

10. Método de síntesis de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que dicho método comprende la etapa de incorporar un compuesto según la reivindicación 4 o 5 durante la síntesis de oligonucleótidos.

5 11. Método de síntesis de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por

que dicho método comprende las etapas de:

a) incorporar un compuesto según la reivindicación 4 o 5 durante la síntesis de oligonucleótidos, en la que X de dicho compuesto según la reivindicación 4 o 5 es un grupo reactivo o un conector con un grupo reactivo, y

10 b) acoplar una entidad de señal con dicho grupo reactivo.