Cultivos con resistencia mejorada a fagos.

Un método para generar un cultivo de inicio que comprende al menos dos variantes de una cepa resistente a bacteriófagos,

que comprende los pasos de:

(a) la exposición de una cepa bacteriana precursora que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR a un bacteriófago para producir una mezcla de bacterias que comprende una variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

(b) la exposición independiente de la misma cepa bacteriana precursora que en el paso (a) que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR al mismo bacteriófago que en el paso (a) para producir una mezcla de bacterias que comprende otra variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

(c) la selección de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos de dichas mezclas de bacterias;

(d) la selección de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos que comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada de dichas cepas resistentes a bacteriófagos seleccionadas en el paso (c); y

(e) el aislamiento de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos, donde dichas cepas comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

donde la secuencia de al menos un espaciador adicional en la variante de la cepa resistente a bacteriófagos es diferente de la secuencia de al menos un espaciador adicional en la otra cepa resistente a bacteriófagos.

Cultivos con resistencia mejorada a fagos Campo de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones que encuentran uso en el desarrollo y el uso de combinaciones de cepas y rotaciones de cultivo de inicio.

Antecedentes de la Invención Cultivos, y cultivos de inicio, en particular, se utilizan ampliamente en la industria alimentaria en la fabricación de productos fermentados incluidos los productos lácteos (por ejemplo, yogur, mantequilla y queso) , productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales. La preparación de los cultivos es una labor intensiva, que ocupa mucho espacio y equipo, y existe un riesgo considerable de contaminación con bacterias de putrefacción y/o fagos durante las etapas de propagación. El fracaso de los cultivos bacterianos, debido a la infección por un bacteriófago (fago) y a la multiplicación es un problema importante con el uso industrial de cultivos bacterianos. Hay muchos tipos diferentes de fagos y nuevas cepas siguen apareciendo. Además, existe la necesidad de métodos y composiciones para el seguimiento de las bacterias utilizadas en dichos cultivos. De hecho, a pesar de los avances en el desarrollo de cultivos, existe una continua necesidad de mejorar los cultivos para su uso en la industria.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones que encuentran uso en el desarrollo y el uso de combinaciones de cepas y rotaciones de cultivo de inicio.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un método para la generación de un cultivo de inicio que comprende al menos dos variantes de una cepa resistente a bacteriófagos, que comprende las etapas de: (a) la exposición de una cepa bacteriana precursora, que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR, a un bacteriófago para producir una mezcla de bacterias que comprende una variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada; (b) la exposición independiente de la misma cepa bacteriana precursora que en el paso (a) que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR al mismo bacteriófago que en el paso (a) para producir una mezcla de bacterias que comprende otra variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada; (c) la selección de dichas variantes de las cepas resistentes a bacteriófagos de dichas mezclas de bacterias; (d) la selección de dichas variantes de las cepas resistentes a bacteriófagos que comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada de dichas cepas resistentes a bacteriófagos seleccionadas en el paso (c) ; y (e) el aislamiento de dichas variantes de las cepas resistentes a bacteriófagos, donde dichas cepas comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada; donde la secuencia de al menos un espaciador adicional en la variante de la cepa resistente a bacteriófagos es diferente de la secuencia de al menos un espaciador adicional en la otra cepa resistente a bacteriófagos.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un cultivo de inicio obtenido mediante el método de la presente invención.

De acuerdo con un tercer aspecto, la invención proporciona un método de fermentación que comprende la adición del cultivo de inicio de la invención a un medio de fermentación, en condiciones tales que tenga lugar la fermentación de los componentes de dicho medio de fermentación.

En algunas modalidades preferidas, el bacteriófago se selecciona de un grupo de familias de virus que consiste en: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, y Tectiviridae. En algunas modalidades preferidas adicionales, el bacteriófago es un bacteriófago natural, mientras que en otras modalidades preferidas, el bacteriófago es un bacteriófago mutado obtenido mediante presión selectiva utilizando una cepa bacteriana resistente a bacteriófagos. Aún en otras modalidades, la cepa resistente a bacteriófagos es una mutante insensible a bacteriófagos. Todavía en otras modalidades, la cepa bacteriana precursora es una mutante insensible a bacteriófagos. En algunas otras modalidades, las porciones terminales 5’ y/o 3’ de la ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora se comparan con la ubicación CRISPR modificada de la variante de la cepa resistente a bacteriófagos. En algunas modalidades adicionales más, las porciones terminales 5’ y/o 3’ del primer espaciador CRISPR de la ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora se comparan con la ubicación CRISPR modificada de la variante de la cepa resistente a bacteriófagos. En algunas modalidades adicionales, por lo menos una parte de la ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora y, por lo menos una parte de la ubicación CRISPR modificada de la variante de la cepa resistente a bacteriófagos, se comparan amplificando por lo menos una parte de la ubicación CRISPR y al menos, una parte de la ubicación CRISPR modificada, para producir una secuencia amplificada de la ubicación CRISPR y una amplificación de la secuencia de la ubicación CRISPR modificada. En aún más modalidades, la amplificación se realiza mediante la reacción en

cadena de la polimerasa. En algunas modalidades preferidas, por lo menos una parte de la ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora y por lo menos una parte de la ubicación CRISPR modificada de la variante de la cepa resistente a bacteriófagos, se comparan secuenciando por lo menos una parte de la ubicación CRISPR y al menos un parte de la ubicación CRISPR modificada. En algunas modalidades preferidas en particular, los métodos además comprenden la etapa de secuenciar la secuencia amplificada de la ubicación CRISPR y la secuencia amplificada de la ubicación CRISPR modificada. En algunas modalidades adicionales, el espaciador adicional en la ubicación CRISPR modificada, forma una unidad de espaciador repetido adicional. En algunas modalidades preferidas, la unidad de espaciador repetido adicional comprende al menos alrededor de 44 nucleótidos. En algunas modalidades alternativas preferidas, la unidad de espaciador repetido adicional está compuesta por alrededor de entre 44 y alrededor de 119 nucleótidos. Sin embargo, no es la intención que la presente invención se limite a estos intervalos de tamaño específicos, ya que se ha encontrado uso para otros tamaños en la presente invención, tal como se describe en este documento. En algunas modalidades, la unidad de espaciador repetido adicional, comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos alrededor del 95% de identidad de una repetición CRISPR en la ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora. En algunas otras modalidades, la unidad espaciador repetido adicional, comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos alrededor del 95% de identidad de una secuencia de nucleótidos en el genoma de al menos un bacteriófago. En algunas modalidades preferidas en particular, la cepa bacteriana precursora, es una cepa industrialmente útil. En algunas modalidades adicionales preferidas, la cepa bacteriana precursora es susceptible a la infección por lo menos por un bacteriófago. En algunas modalidades preferidas adicionales, la cepa bacteriana precursora, comprende un cultivo seleccionado de cultivos de inicio, cultivos probióticos y cultivos de suplemento dietético. En algunas modalidades preferidas, la cepa bacteriana precursora comprende una cepa obtenida de un cultivo. En algunas modalidades preferidas en particular, el cultivo es un cultivo de inicio, un cultivo probiótico, y/o un cultivo de suplemento dietético. Más aún en modalidades adicionales, la cepa bacteriana precursora se selecciona de Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Cor y nebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Campylobacter, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, y Oenococcus.

Se describe al menos una variante de la cepa resistente a bacteriófagos obtenida mediante los métodos establecidos en el presente. Se describen variantes de las cepas resistentes a bacteriófagos, en las que la variante de la cepa resistente a bacteriófagos es una cepa industrialmente... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar un cultivo de inicio que comprende al menos dos variantes de una cepa resistente a bacteriófagos, que comprende los pasos de:

(a) la exposición de una cepa bacteriana precursora que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR a un bacteriófago para producir una mezcla de bacterias que comprende una variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

(b) la exposición independiente de la misma cepa bacteriana precursora que en el paso (a) que comprende al menos una porción de una ubicación CRISPR al mismo bacteriófago que en el paso (a) para producir una mezcla de bacterias que comprende otra variante de la cepa resistente a bacteriófagos que comprende una ubicación CRISPR modificada que comprende al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

(c) la selección de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos de dichas mezclas de bacterias;

(d) la selección de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos que comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada de dichas cepas resistentes a bacteriófagos seleccionadas en el paso (c) ; y

(e) el aislamiento de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos, donde dichas cepas comprenden un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada;

donde la secuencia de al menos un espaciador adicional en la variante de la cepa resistente a bacteriófagos es diferente de la secuencia de al menos un espaciador adicional en la otra cepa resistente a bacteriófagos.

2. El método de la Reivindicación 1, donde dicho método comprende además la etapa de comparar dicha ubicación CRISPR o una porción de la misma de dicha cepa bacteriana precursora y dicha ubicación CRISPR modificada de las variantes de la cepa resistente a bacteriófagos para identificar las variantes de la cepa resistente a bacteriófagos que comprenden al menos un espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada que está ausente de dicha ubicación CRISPR de dicha cepa bacteriana precursora.

3. El método de la Reivindicación 1, donde dicho bacteriófago se selecciona del grupo de familias de virus que consiste en: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, y Tectiviridae.

4. El método de la Reivindicación 1, donde dicho bacteriófago es un bacteriófago de origen natural o es un bacteriófago mutado obtenido mediante presión selectiva utilizando una bacteria resistente a bacteriófagos.

5. El método de la Reivindicación 1, donde dichas cepas resistentes a bacteriófagos o dicha cepa bacteriana precursora es una mutante insensible a bacteriófagos.

6. El método de la Reivindicación 1, donde las porciones terminales 5’ y/o 3’ de dicha ubicación CRISPR de la cepa bacteriana precursora se comparan con dicha ubicación CRISPR modificada de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos.

7. El método de la Reivindicación 1, donde las porciones terminales 5’ y/o 3’ de al menos el primer espaciador CRISPR de dicha ubicación CRISPR de dicha cepa bacteriana precursora se comparan con dicha ubicación CRISPR modificada de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos.

8. El método de la Reivindicación 1, donde dicha al menos una porción de dicha ubicación CRISPR de dicha cepa bacteriana precursora y al menos una porción de dicha ubicación CRISPR modificada de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos se comparan al amplificar, preferiblemente utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, al menos una porción de dicha ubicación CRISPR y al menos una porción de dicha ubicación CRISPR modificada, para producir una secuencia de ubicación CRISPR amplificada y una secuencia de ubicación CRISPR modificada amplificada.

9. El método de la Reivindicación 1, donde dicha al menos una porción de dicha ubicación CRISPR de dicha cepa bacteriana precursora y al menos una porción de dicha ubicación CRISPR modificada de dichas variantes de la cepa resistente a bacteriófagos se comparan al procesar por secuencia al menos una porción de dicha ubicación CRISPR y al menos una porción de dicha ubicación CRISPR modificada.

10. El método de la Reivindicación 8, que además comprende la etapa de procesar por secuencia dicha secuencia de ubicación CRISPR amplificada y dicha secuencia de ubicación CRISPR modificada amplificada.

11. El método de la Reivindicación 1, donde dicho espaciador adicional en dicha ubicación CRISPR modificada forma parte de una unidad espaciadora de repetición.

12. El método de la Reivindicación 1, donde al menos uno de dichos espaciadores adicionales forma parte de una unidad espaciadora de repetición que comprende al menos 44 nucleótidos o donde dicha unidad espaciadora de repetición adicional comprende entre 44 nucleótidos y 119 nucleótidos.

13. El método de la Reivindicación 1, donde al menos uno de dichos espaciadores adicionales forma parte de una unidad espaciadora de repetición que comprende al menos una secuencia de nucleótido que tiene al menos 95% de identidad con una repetición CRISPR en dicha ubicación CRISPR de dicha cepa bacteriana precursora.

14. El método de la Reivindicación 1, donde al menos uno de dichos espaciadores adicionales forma parte de una unidad espaciadora de repetición que comprende al menos una secuencia de nucleótido que tiene al menos 95% de identidad con una secuencia de nucleótido en el genoma de dicho bacteriófago.

15. El método de la Reivindicación 1, donde dicha cepa bacteriana precursora es una cepa útil en la industria.

16. El método de la Reivindicación 15, donde dicha cepa bacteriana precursora es susceptible a infección por al menos un bacteriófago.

17. El método de la Reivindicación 15, donde dicha cepa bacteriana precursora es una cepa obtenida de un cultivo seleccionado de cultivos de inicio, cultivos probióticos, y cultivos de suplementos dietéticos.

18. El método de la Reivindicación 1, donde dicha cepa bacteriana precursora se selecciona de Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Cor y nebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Campylobacter, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus.

19. Un cultivo de inicio obtenido mediante el método de la Reivindicación 1.

20. Un método de fermentación que comprende agregar el cultivo de inicio de la Reivindicación 19 a un medio de fermentación, bajo condiciones tales que ocurra la fermentación de los componentes de dicho medio de fermentación.

21. El método de la Reivindicación 20, donde dicha fermentación no se ve afectada por la presencia de bacteriófagos.

22. El método de la Reivindicación 20, donde dicho medio de fermentación es un producto alimenticio tal como un producto lácteo, por ejemplo, leche.

23. El método de la Reivindicación 20, donde dicho medio de fermentación se expone secuencialmente a al menos dos cultivos de inicio diferentes.

FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 FIGURA 10 FIGURA 11

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FIGURA 21 FIGURA 22

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