Procedimiento de conjugación de un antígeno bacteriano con una proteína vehículo.

Un procedimiento de conjugación de un antígeno que comprende las etapas de:

a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

b) hacer reaccionar el antígeno activado y una proteína vehículo para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y

c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno conjugado; o

a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

b') hacer reaccionar el antígeno activado y un enlazador para formar un grupo imina que une el antígeno activado al enlazador;

c') reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno-enlazador y

d) hacer reaccionar un antígeno-enlazador con una proteína vehículo para formar un antígeno conjugado; en el que el antígeno se origina a partir de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi o Staphylococcus epidermidis, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano y en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con peryodato.

Procedimiento de conjugación de un antígeno bacteriano con una proteína vehículo La presente invención se refiere a un procedimiento de conjugación, en particular mediante aminación reductora usando el agente reductor triacetoxiborohidruro de sodio. La presente invención también proporciona un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende un conjugado de la invención.

Antecedentes Los niños menores de 2 años de edad no desarrollan una respuesta inmunitaria a la mayor parte de las vacunas de polisacáridos, de modo que ha sido necesario obtener los inmunógenos polisacáridos mediante conjugación química con una proteína vehículo. Acoplar el polisacárido, un antígeno independiente de T, a una proteína, un antígeno dependiente de T, confiere al polisacárido las propiedades de dependencia de T que incluyen cambio de isotipos, maduración de afinidad e inducción de memoria. El Streptococcus pneumoniae es una bacteria gram-positiva responsable de una morbimortalidad considerable (en particular en personas jóvenes y ancianas) , que provoca enfermedades invasivas tales como neumonía, bacteremia y meningitis, y enfermedades asociadas con colonización, tales como otitis media aguda. Se estima que la tasa de neumonía por neumococos en Estados Unidos para personas de más de 60 años de edad es de 3 a 8 por 100.000. En el 20 % de los casos esta desencadena bacteremia y otras manifestaciones tales como meningitis, con una tasa de mortalidad cercana al 30 % incluso con tratamiento con antibióticos.

El neumococo está encapsulado con un polisacárido unido químicamente que confiere especificidad de serotipo. Existen 90 serotipos conocidos de neumococos y la cápsula es el determinante de virulencia principal para los neumococos, ya que la cápsula no solo protege la superficie interna de la bacteria del complemento, sino que por sí misma es poco inmunógena. Los polisacáridos son antígenos independientes de T y no pueden procesarse o presentarse en moléculas del CMH para interactuar con linfocitos T. No obstante, pueden estimular el sistema inmunitario mediante un mecanismo alternativo que implica la reticulación de receptores de superficie de linfocitos B.

Se ha mostrado en varios experimentos que la protección contra una enfermedad por neumococos invasiva está correlacionada del modo más intenso con un anticuerpo específico para la cápsula y la protección es específica del serotipo.

El Streptococcus pneumoniae es la causa más común de enfermedad bacteriana invasiva y de otitis media en recién nacidos y niños pequeños. Asimismo, los ancianos desarrollan unas respuestas reducidas a vacunas de neumococos [Roghmann y col., (1987) , J. Gerontol. 42:265-270], de ahí la incidencia aumentada de neumonía bacteriana en esta población [Verghese y Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].

La conjugación de sacáridos de Streptococcus pneumoniae usando iones cianoborohidruro es conocida, por ejemplo por el documento WO87/06838. No obstante, los iones cianoborohidruro tienen varias desventajas que incluyen un tiempo de reacción relativamente lento y la posible contaminación del producto con cianuro (Ahmed F. y col., J.Org.Chem., 1996, 61:3849-3862) . El tiempo de reacción lento usando este reactivo se aborda en el documento EP1035137, que describe un intento de mejorar el tiempo de reacción de este procedimiento de conjugación mediante el uso de radiación de microondas.

Ahmed y col. han descrito la aminación reductora de aldehídos y cetonas con triacetoxiborohidruro de sodio (NaBH (OAc) 3) (J. Org. Chem., 1996, 61:3849-3862) . De forma similar, la aminación reductora de carbohidratos usando NaBH (OAc) 3 se ha descrito por Dalpathado y col. (Anal. Bioanal. Chem (2005) 281:130-1137) .

En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado de conjugación de un antígeno mediante aminación reductora usando aniones triacetoxiborohidruro (BH (OA) 3) en el agente reductor. Los inventores han descubierto que este agente reductor es adecuado para su uso en la conjugación de sacáridos bacterianos con proteínas vehículo; en particular esta reacción es más rápida que la reacción equivalente usando iones cianoborohidruro y no produce subproductos tóxicos.

Sumario de la invención En un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de conjugación de un antígeno que comprende las etapas de a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

b) hacer reaccionar el antígeno activado y una proteína vehículo para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno conjugado; o a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

b) hacer reaccionar el antígeno activado y un enlazador para formar un grupo imina que une el antígeno activado al enlazador;

c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno-enlazador y d) hacer reaccionar el antígeno-enlazador con una proteína vehículo para formar un antígeno conjugado;

en el que el antígeno se origina a partir de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi o Staphylococcus epidermidis, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano y en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con per y odato.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de conjugación de un antígeno que comprende las etapas de a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

a) liofilizar el antígeno activado y una proteína vehículo, operación seguida por reconstitución en DMSO o DMF;

b) hacer reaccionar el antígeno activado y la proteína vehículo para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno conjugado; o a) activar el antígeno para formar un antígeno activado;

a) liofilizar el antígeno activado y un enlazador, operación seguida por reconstitución en DMSO o DMF;

b) hacer reaccionar el antígeno activado y el enlazador para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno-enlazador;

d) hacer reaccionar el antígeno-enlazador con una proteína vehículo para formar un antígeno conjugado, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano y en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con per y odato.

Se divulga una composición inmunógena que comprende el antígeno conjugado mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se divulga una composición inmunógena que puede obtenerse mediante el procedimiento de la invención.

Se divulga una composición inmunógena obtenida mediante el procedimiento de la invención.

Se divulga una vacuna que comprende dicha composición inmunógena.

Se divulga el uso de dicha composición inmunógena en la prevención o el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo una enfermedad bacteriana.

Se divulga el uso de dicha composición inmunógena en la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en meningitis bacteriana, enfermedad por neumococos, enfermedad por Haemophilus influenzae, enfermedad por meningococos, enfermedad por estafilococos, enfermedad por enterococos y enfermedad por Salmonella.

Se divulga el uso de dicha composición inmunógena en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo una enfermedad bacteriana.

Se divulga el uso de dicha composición inmunógena en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en meningitis bacteriana, enfermedad por neumococos, enfermedad por Haemophilus influenzae, enfermedad por meningococos, enfermedad por estafilococos, enfermedad por enterococos y enfermedad por Salmonella.

Se divulga un procedimiento de prevención o de tratamiento de una infección, por ejemplo una infección bacteriana, que comprende administrar dicha composición inmunógena a un paciente.

Se divulga un procedimiento de prevención o de tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en meningitis bacteriana, enfermedad por neumococos, enfermedad por... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de conjugación de un antígeno que comprende las etapas de:

a) activar el antígeno para formar un antígeno activado; b) hacer reaccionar el antígeno activado y una proteína vehículo para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno conjugado; o a) activar el antígeno para formar un antígeno activado; b) hacer reaccionar el antígeno activado y un enlazador para formar un grupo imina que une el antígeno activado al enlazador; c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno-enlazador y d) hacer reaccionar un antígeno-enlazador con una proteína vehículo para formar un antígeno conjugado;

en el que el antígeno se origina a partir de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Salmonella Vi o Staphylococcus epidermidis, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano y en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con per y odato.

2. Un procedimiento de conjugación de un antígeno que comprende las etapas de:

a) activar el antígeno para formar un antígeno activado; a) liofilizar el antígeno activado y una proteína vehículo, operación seguida por reconstitución en DMSO o DMF; b) hacer reaccionar el antígeno activado y la proteína vehículo para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo; y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno conjugado; o a) activar el antígeno para formar un antígeno activado; a) liofilizar el antígeno activado y un enlazador, operación seguida por reconstitución en DMSO o DMF; b) hacer reaccionar el antígeno activado y el enlazador para formar un grupo imina que une el antígeno activado a la proteína vehículo y c) reducir el grupo imina usando un agente reductor que comprende un resto triacetoxiborohidruro para formar un antígeno-enlazador; d) hacer reaccionar el antígeno-enlazador con una proteína vehículo para formar un antígeno conjugado, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano y en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con per y odato.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente reductor no contiene un resto cianoborohidruro.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el antígeno es un sacárido bacteriano que se origina a partir de S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis, S.aureus, E.faecalis, E.faecium, Salmonella Vi

o S.epidermidis.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el antígeno es un sacárido capsular bacteriano de un serotipo de S.pneumoniae seleccionado del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el sacárido bacteriano es el sacárido capsular de S.pneumoniae 23F.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el sacárido bacteriano es el sacárido capsular de S.pneumoniae 6B.

8. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que el sacárido bacteriano es un polisacárido u oligosacárido de Haemophilus influenzae b (Hib) .

9. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína vehículo es una proteína seleccionada del grupo que consiste en toxoide del tétanos (TT) , fragmento C de TT, toxoide de la difteria, CRM197, neumolisina, proteína D, PhtD, PhtDE y N19.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el antígeno y la proteína vehículo se liofilizan después de la etapa a) .

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el antígeno y la proteína vehículo se liofilizan en presencia de

un azúcar no reductor.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa a) comprende hacer reaccionar el antígeno con 0, 0001-0, 7 equivalentes molares de per y odato.

13. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior que comprende una etapa adicional e) de purificar el

antígeno conjugado y/o que comprende una etapa adicional f) en el que el antígeno conjugado se filtra de forma estéril y/o una etapa adicional de mezclado del antígeno conjugado con antígenos adicionales.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que los antígenos adicionales comprenden al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sacáridos de S.pneumoniae seleccionados del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el antígeno conjugado se mezcla con un coadyuvante opcionalmente, en el que el coadyuvante es una sal de aluminio.