Procedimiento de conjugación de polisacáridos bacterianos con proteínas transportadoras.

Un procedimiento de conjugación de un sacárido bacteriano que comprende las etapas de

a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0,

001-0,7 equivalentes molares de peryodato para formar un sacárido bacteriano activado;

b) mezclar el sacárido bacteriano activado con una proteína transportadora;

c) hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado y la proteína transportadora con un agente reductor para formar un conjugado;

o

a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0,001-0,7, equivalentes molares de peryodato para formar un sacárido bacteriano activado;

b) mezclar el sacárido bacteriano activado con un enlazador;

c') hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado con el enlazador utilizando un agente reductor para formar un sacárido bacteriano-enlazador;

d) hacer reaccionar el sacárido bacteriano-enlazador con una proteína transportadora para formar un conjugado, en el que la etapa a) ocurre en un tampón que no contiene ningún grupo amino y el tampón tiene una concentración de entre 1-100 mM y en el que el sacárido bacteriano es el sacárido capsular 6B de S. pneumoniae.

Procedimiento de conjugación de polisacáridos bacterianos con proteínas transportadoras La presente invención se refiere a un procedimiento de conjugación. En particular, se refiere a la conjugación de sacáridos y proteínas utilizando aminación reductora.

Antecedentes Los polisacáridos capsulares bacterianos han sido utilizados ampliamente en inmunología durante muchos años para la prevención de la enfermedad bacteriana. Un problema con un uso de este tipo, sin embargo, es la naturaleza T-independiente de la respuesta inmunitaria. Estos antígenos son por tanto poco inmunogénicos en niños pequeños. Este problema se ha superado a través de la conjugación de los antígenos polisacáridos con una proteína transportadora (una fuente de epítopos de linfocitos T cooperadoras) que pueden entonces utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria T-dependiente, incluso en el primer año de vida.

Se conocen diversas técnicas de conjugación en la técnica. Los conjugados pueden prepararse mediante procedimientos de aminación reductora directa como se describe en los documentos US200710184072 (Hausdorff) , US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson) . Se describen otros procedimientos en los documentos EP-0-16115 188, EP-208375 y EP-0-477508. El procedimiento de conjugación puede depender como alternativa de la activación de grupos hidroxilo del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. Dichos conjugados se describen en la solicitud publicada del PCT WO 93/15760 Universidad de Servicios Uniformados y WO 95/08348 y WO 96/29094. Véase también Chu C. y col. infect. Immunity, 1983 245 256.

La aminación reductora implica das etapas, (I) la oxidación del antígeno, (2) la reducción del antígeno y de una 20 proteína transportadora para formar un conjugado. La etapa de oxidación puede implicar la reacción con per y odato, sin embargo la oxidación por per y odato puede conducir a la reducción de tamaño (documento WO94/05325) .

Sumario de la invención Los inventores han descubierto sorprendentemente que el uso de concentraciones más bajas de per y odato en presencia de fosfato bajo puede conducir a la retención del tamaño y/o la retención de los epítopos.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para conjugar un sacárido o sacáridos bacterianos que comprende las etapas a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7, (por ejemplo 0, 005-0, 5, 0, 01-0, 5, 0, 1-0, 5, o 0, 1-0, 2) equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado; b) mezclar el sacárido bacteriano activado con una proteína transportadora;

c) hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado y la proteína transportadora con un agente reductor para formar un conjugado; o a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7, (por ejemplo, 0, 005-0, 5, 0, 01-0, 5, 0, 1-0, 5, o 0, 1-0, 2) equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado;

b) mezclar el sacárido bacteriano activado con un enlazador; c') hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado con el enlazador utilizando un agente reductor para formar un sacárido bacteriano-enlazador; d) hacer reaccionar el sacárido bacteriano-enlazador con una proteína transportadora para formar un conjugado,

en el que la etapa a) se produce en un tampón que no contiene un grupo amino y el tampón tiene una concentración 40 de entre 1-100 mM.

Se desvela un conjugado obtenible mediante el procedimiento de la invención.

Se desvela un conjugado obtenido mediante el proceso de la invención.

Se desvela una composición inmunogénica que comprende el conjugado de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se desvela una vacuna que comprende la composición inmunogénica de la invención.

Se desvela un uso de la composición inmunogénica de la invención o de la vacuna de la invención en la prevención o el tratamiento de la enfermedad bacteriana.

Se describe un uso de la composición inmunogénica de la invención o de la vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad bacteriana.

Se desvela un procedimiento para prevenir o tratar la infección bacteriana que comprende la administración de la composición inmunogénica de la invención o de la vacuna de la invención a un paciente.

Se desvela un sacárido bacteriano activado, en el que el sacárido bacteriano activado comprende una unidad de repetición de fórmula (I) :

en la que el sacárido bacteriano activado comprende n unidades de repetición y n está entre 2 y 2400, entre 500 y 2000, entre 750 y 1500, entre 1000 y 2000 o entre 1500 y 2300. En la que al menos el 0, 001 %, 0, 01 %, 0, 1 %, 0, 5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o 30 % pero menos del 0, 001 %, 0, 01 %, 0, 1%, 0, 5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 30% o 50% de S1 es

y el resto es en la que S2 es y en la que S3 es Descripción de los dibujos Figura 1. Tamaño de los polisacáridos 23F y 6B después del tratamiento con per y odato. La línea marcada con triángulos muestra el tamaño de 6B en tampón fosfato 10 mM, la línea marcada con diamantes muestra el

tamaño de 23F en tampón fosfato 10 mM y la línea marcada con cuadrados muestra el tamaño de 23F en tampón fosfato 100 mM.

Figura 2. Comparación de la inmunogenicidad de 23F conjugado utilizando ya sea CDAP o conjugación de aminación reductora. El gráfico a) describe los resultados de un ensayo ELISA. El gráfico b) describe los resultados de un ensayo de opsonofagocitosis.

Figura 3. Evaluación de la inmunogenicidad de PS06B-CRM conjugado utilizando los procedimientos de conjugación descritos en el ejemplo 4 en un modelo de ratón Balb/c.

Figura 4. Evaluación de la inmunogenicidad de PS06B-CRM conjugado utilizando los procedimientos de conjugación descritos en el ejemplo 4 en un modelo de conejillo de indias.

Descripción detallada de la invención La invención se refiere a un procedimiento mejorado para conjugar un antígeno con una proteína transportadora. En particular, la invención proporciona un procedimiento para conjugar un sacárido o sacáridos bacterianos que comprende las etapas a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7 equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado; b) mezclar el sacárido bacteriano activado con una proteína transportadora; c) hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado y la proteína transportadora con un agente reductor para formar un conjugado; o a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7 equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado; b) mezclar el sacárido bacteriano activado con un enlazador; c') hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado con el enlazador utilizando un agente reductor para formar un sacárido bacteriano-enlazador; d) hacer reaccionar el sacárido bacteriano-enlazador con una proteína transportadora para formar un conjugado,

en el que la etapa a) se produce en un tampón que no contiene un grupo amino y el tampón tiene una concentración de entre 1-100 mM.

El término "per y odato" incluye tanto el per y odato como el ácido per y ódico. Este término también incluye tanto el metaper y odato (IO4-) como el ortoper y odato (IO65-) , sin embargo en una realización particular, el per y odato utilizado en el procedimiento de la invención es metaper y odato. El término "per y odato" también incluye las diversas sales de per y odato incluyendo el per y odato de sodio y el per y odato de potasio. En una realización el per y odato utilizado es metaper y odato de sodio. Cuando un antígeno reacciona con per y odato, el per y odato oxida los grupos hidroxilo vecinales para formar grupos carbonilo o aldehído y provoca la escisión de un enlace C-C. Por esta razón la expresión "hacer reaccionar un antígeno con per y odato" incluye la oxidación de los grupos hidroxilo vecinales mediante per y odato.

Para los fines de la invención un "sacárido bacteriano activado" es un sacárido bacteriano que se ha activado mediante la etapa a) del proceso de la invención.

Para los fines de la invención, el término "conjugado" indica un sacárido bacteriano ligado covalentemente a una proteína transportadora. En una realización un sacárido bacteriano está unido directamente a una proteína transportadora. En una segunda realización, un sacárido bacteriano está ligado a una proteína a través de un espaciador/enlazador.

El tampón utilizado en la etapa a) es un tampón que no contiene un grupo amino. En una realización el tampón se selecciona... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de conjugación de un sacárido bacteriano que comprende las etapas de a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7 equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado;

b) mezclar el sacárido bacteriano activado con una proteína transportadora; c) hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado y la proteína transportadora con un agente reductor para formar un conjugado; o a) hacer reaccionar el sacárido bacteriano con 0, 001-0, 7, equivalentes molares de per y odato para formar un sacárido bacteriano activado; b) mezclar el sacárido bacteriano activado con un enlazador; c') hacer reaccionar el sacárido bacteriano activado con el enlazador utilizando un agente reductor para formar un sacárido bacteriano-enlazador; d) hacer reaccionar el sacárido bacteriano-enlazador con una proteína transportadora para formar un conjugado,

en el que la etapa a) ocurre en un tampón que no contiene ningún grupo amino y el tampón tiene una concentración de entre 1-100 mM y en el que el sacárido bacteriano es el sacárido capsular 6B de S. pneumoniae.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el tampón se selecciona entre el grupo que consiste en tampón fosfato, tampón borato, tampón acetato, tampón carbonato y tampón citrato opcionalmente en el que el tampón tiene una concentración de entre 1-50 mM, 1-25 mM, 1-10 mM, 5-15 mM, 8-12 mM, 10-50 mM o aproximadamente 10 mM.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que el pH en la etapa a) es pH 3, 5-8, 0, 5, 07, 0 o pH 5, 5-6, 5 o aproximadamente pH 6, 0.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que el peso molecular promedio del sacárido

bacteriano es de entre 1-1100 kDa.

10. 470 kDa.

20. 300 kDa.

60. 1100 kDa .

80. 1000 kDa después de la etapa 25 a) .

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el proteína transportadora se selecciona entre el grupo que consiste en toxoide tetánico, fragmento C del toxoide tetánico, toxoide diftério, CRM197, neumolisina, proteína D, PhtD, PhtDE y N19.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente reductor comprende 30 cianoborohidruro de sodio o triacetoxiborohidruro de sodio.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende una etapa adicional e) de purificación del conjugado.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que contiene una etapa adicional de mezcla del conjugado con antígenos adicionales opcionalmente, en el que los antígenos adicionales comprenden al menos 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sacáridos de S. pneumoniae seleccionados entre el grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F.

9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que los antígenos adicionales comprenden una o más proteínas de S. pneumoniae seleccionadas entre el grupo que consiste en la familia de poli-histidina en triada (PhtX) , la familia de proteínas de unión a la colina (CbpX) , truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncado de CbpX-truncado de LytX, neumolisina (Ply) , PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 y SP133.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el conjugado se mezcla con un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable.