Composiciones y procedimientos de producción de metionina.

Un polipéptido aislado con actividad de homoserina O-succiniltransferasa,

que muestra una sensibilidad reducida ante la inhibición por retroalimentación por L-metionina en comparación con un polipéptido de homoserina O-succiniltransferasa de tipo silvestre derivado de E. coli, y que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12165779.

Solicitante: CJ CHEILJEDANG CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: CJ BLDG. 500 NAMDAEMUNNO 5-GA JUNG-GU SEOUL 100-749 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: JESSEN,HOLLY,J, CHO,Kwang-Myung, Shin,Yong Uk, BRAZEAU,BRIAN, CHANG,JIN-SOOK, CHO,YOUNG WOOK, DESOUZA,MERVYN, KIM,SO-YOUNG, NIU,WEI, SANCHEZ-RIERA,FERNANDO A, UM,HYEWON.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12P13/12 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Metionina; Cisteína; Cistina.

PDF original: ES-2534375_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Composiciones y procedimientos de producción de metionina CAMPO

Se dan a conocer composiciones, tales como microorganismos, enzimas y productos químicos, así como procedimientos para el uso de las mismas para producir metionina y productos relacionados.

ANTECEDENTES

La metionina es un aminoácido esencial en la dieta animal. La metionina se ha producido sintéticamente durante un extenso periodo de tiempo mediante diversas síntesis químicas multietapa que emplean acroleína, metilmercaptano y cianuro como materiales de partida. Existen dos formas de producto: D,L-metionina y su análogo hidroxllico. La D- metionina se convierte en el isómero L necesario in vivo, al contrario que todos los demás aminoácidos. Se ha reseñado que el mercado para metionina de pureza alimentaria está mejorando debido a una demanda aumentada en suplementos alimentarios para aves de corral y más recientemente cerdos. La capacidad de los productores líderes de metionina (Degussa AG, Adisseo y Novus) de satisfacer la demanda del mercado depende de los suministros de material bruto. Los intermedios acroleína y metilmercaptano deben convertirse en 3- metiltiopropionaldehído (MMP) y después en metionina usando cianuro de hidrógeno. Los tres productores tienen planes para la expansión de sus instalaciones de producción de metionina e integración con la producción de material bruto también (Chem. Marketing Repórter de 7 de abril de 2003).

Las rutas biosintéticas para metionina (un miembro de la familia de aminoácidos de tipo aspartato) se han estudiado en una serie de organismos y muestran similitudes así como diferencias. La primera etapa dedicada, la acilación de homoserina, se cataliza por la homoserina aciltransferasa, y es ubicua en todos los organismos a pesar de las diferencias en el grupo acilo transferido. El producto de la catálisis de metA es acetilhomoserina o succinilhomoserina. La acilhomoserina se convierte entonces en homocistelna a través de una ruta de transulfuración o sulfhidrilación directa. Se ha reseñado que ambas rutas están presentes y son funcionales en levadura, hongos, plantas verdes y la bacteria Corynebacterium glutamicum. E. coli posee solo la ruta de transulfuración. La ruta de transulfuración pasa por cistationina como intermedio y utiliza cisterna como donante de azufre. La ruta de sulfhidrilación directa implica la incorporación directa de sulfuro a la acilhomoserina. La última etapa de la ruta implica la conversión de homocistelna en metionina catalizada por una homocistelna metiltransferasa, codificada por los genes metE o metH. Otros aminoácidos importantes, tales como lisina, treonina y triptófano, se producen a través de la fermentación para uso en alimentación animal. Por lo tanto, estos aminoácidos pueden prepararse usando glucosa y otras fuentes renovables como materiales de partida. Desgraciadamente, la producción de metionina a través de la fermentación no ha sido tan exitosa y se usa todavía actualmente la síntesis química de metionina. Esto es en parte debido a la falta de una ruta biosintética genomanipulada eficaz para la producción de metionina y de un hospedador de producción adecuado.

El documento WO 2005/108561 se refiere a una enzima homoserina transuccinilasa recombinante con sensibilidad de retroalimentación alterada y a enzimas S-adenosilmetionina sintetasa recombinantes con actividad reducida para la producción de metionina.

El documento WO 2004/038013 se refiere a una homoserina transuccinilasa que exhibe una sensibilidad reducida hacia L-metionina o S-adenosilmetionina en comparación con una enzima homoserina transuccinilasa de tipo silvestre.

El documento WO 2004/035617 se refiere a una homoserina transuccinilasa que tiene al menos una mutación en comparación con una homoserina transuccinilasa de tipo silvestre y sensibilidad reducida hacia L-metionina o S- adenosilmetionina, en comparación con la enzima de tipo silvestre.

El documento WO 2006/138689 se refiere a cepas bacterianas genomanipuladas para aumentar la producción de aminoácidos, incluyendo aminoácidos derivados de aspartato.

El documento JP2000139471 se refiere a procedimientos de producción de L-metionina mediante el cultivo de un microorganismo capaz de producir L-metionina y por fermentación usando el mismo microorganismo.

Usuda et al., "Effects of deregulation of methionine biosynthesis on methionine excretion in Escherichia coli", Applied and Environmental Microbioloav. 71(6): 3228-3234, 2005, se refiere a los efectos de la desrregulacion de la biosíntesis de metionina sobre la excreción de metionina en E. coli.

La siguiente divulgación proporciona una ruta biosintética de metionina mejorada, así como un hospedador de producción.

SUMARIO

El objeto en cuestión para el que se busca protección es como se define en las reivindicaciones.

Se describe en la presente memoria la producción de metionina y productos relacionados, tales como S- adenosilmetionina (SAMe), mediante fermentación. Se describen también microorganismos que se han genomanipulado para incluir moléculas de ADN recombinante y producir metionina.

Se describe un microorganismo que incluye una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica un péptido que tiene actividad de sulfhidrilación directa (EC 2.5.1.49, EC 4.2.99-) y secuencias de ácido nucleico endógenas que codifican péptidos que tienen actividad de transulfuración (EC 2.5.1.48 y 4.4.1.8). Este microorganismo puede producir metionina y productos relacionados. En algunos ejemplos, el microorganismo puede tener al menos 0,1, 1, 2, 5, 10, 50, 75, 90 o al menos 100 g/l de concentración extracelular de metionina o SAMe.

En algunos ejemplos, la presencia de más de una ruta biosintética de metionina permite al organismo producir más metionina que la que se produciría en ausencia de la secuencia de ácido nucleico exógena que codifica el péptido que tiene actividad de sulfhidrilación directa.

En otros ejemplos, pueden estar activas más de dos rutas biosintéticas de metionina en el organismo. En estos ejemplos, una o más secuencias de ácido nucleico exógenas codifican péptidos que tienen actividad de sulfhidrilación directa. Uno de estos péptidos puede usar O-succinilhomoserina como sustrato y otro péptido puede usar O-acetilhomoserina como sustrato.

En algunos ejemplos, los microorganismos genomanipulados para preparar metionina y productos relacionados, tales como SAMe, producen al menos un 10 % de la metionina a partir de la actividad de la ruta biosintética de transulfuración. En otros ejemplos, producen al menos un 20, 30, 40 o al menos un 50 % del producto a partir de la actividad de la ruta biosintética de transulfuración.

En algunos ejemplos, los microorganismos genomanipulados para preparar metionina y productos relacionados, tales como SAMe, producen al menos un 10 % de la metionina a partir de la actividad de la ruta biosintética de sulfhidrilación directa. En otros ejemplos, producen al menos un 20, 30, 40 o al menos un 50 % del producto a partir de la actividad de la ruta biosintética de transulfuración.

En algunos ejemplos, el microorganismo genomanipulado para preparar metionina y productos relacionados se ha genomanipulado adicionalmente para atenuar la actividad de un péptido codificado por un gen tal como metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos. En otros ejemplos, el microorganismo se genomanipula para sobreexpresar uno o más genes, tales como los genes metA, metB, metC, metE, metY, metZ, metX metH, cysPWUA, cysD, cysN, cysC, cysH, cysl, cysJ, cysG, cysK y cysM.

Se describen también procedimientos de preparación de metionina y SAMe. Estos procedimientos incluyen cultivar el microorganismo genomanipulado para preparar metionina y productos relacionados y aislar los productos. En algunos ejemplos, el microorganismo puede ser E. coli, Pseudomonas sp. o Corynebacterium glutamicum.

Se proporcionan en la presente memoria secuencias de ácido nucleico novedosas y sus correspondientes secuencias aminoacídicas (SEQ ID NO: 1 y 2). Estas secuencias de ácido nucleico, así como fragmentos y variantes de estas secuencias de ácido nucleico, son útiles para producir péptidos en microorganismos recombinantes. Los péptidos son útiles, entre otros, para producir metionina y SAMe. Los péptidos, variantes de los mismos y fragmentos de los mismos son también útiles para producir agentes de unión específicos tales como anticuerpos.

Se da a conocer también un procedimiento de mejora de la asimilación de azufre sorteando el intermedio fosfoadenililsulfato (PAPS). Este procedimiento puede usarse con cualquier microorganismo usado para producir metionina. El procedimiento se lleva a cabo introduciendo en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polipéptido aislado con actividad de homoserina O-succiniltransferasa, que muestra una sensibilidad reducida ante la inhibición por retroalimentación por L-metionina en comparación con un polipéptido de homoserina O-succiniltransferasa de tipo silvestre derivado de E. coli, y que comprende la secuencia aminoacidica de SEQ ID

NO: 2.

2. Un nucleótido aislado que codifica el péptido aislado según la reivindicación 1.

3. El nucleótido aislado de la reivindicación 2, que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1.

4. Un plásmido que comprende el nucleótido aislado según la reivindicación 2.

5. Una cepa de microorganismo transformada con el plásmido según la reivindicación 4.

6. Un procedimiento de producción de L-metionina que comprende: cultivar el microorganismo según la

reivindicación 5 en condiciones que permitan la producción de L-metionina y aislar la L-metionina asi producida.


 

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