Composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas.

Un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora ante el virus de la gripe en un sujeto,

que comprende:

a) separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural, en la que:

la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que tiene al menos una lámina ß en la parte inferior de la cabeza globular, que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático;

b) transformar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora procariótica;

c) cultivar la célula hospedadora para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, y

d) fusionar al menos una porción de una flagelina con la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural o ligar operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica la flagelina con una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural, en la que la flagelina activa el receptor de tipo Toll 5 (TLR5).

Composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas Antecedentes de la invención La infección por gripe vírica puede conducir a la enfermedad. Las estrategias para prevenir y gestionar la enfermedad asociada a la infección por gripe vírica pueden incluir vacunas con virus inactivados y fármacos. Sin embargo, en dichas estrategias puede ser costoso mantener el suministro a demanda y, por tanto, estar limitado su suministro; pueden dar como resultado una protección variable y un alivio menos que satisfactorio de los síntomas, previniendo o tratando así ineficazmente la enfermedad y, en algunos casos la muerte, consecuencia de la enfermedad asociada a infección por gripe vírica. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos métodos mejorados y eficaces de tratamiento para la prevención y gestión de la enfermedad asociada a infección por gripe vírica.

En Jeon Sung et al. ("Immunization with influenza virus hemagglutinin globular region containing the receptor-binding pocket", VIRAL IMMUNOLOGY, vol. 15, nº 1, 2002, página 165-176) , el constructo de HA usado en D1 (HA91-261) da a conocer un constructo similar a la molécula HA1-3 descrita en la presente memoria (HA101-276, designada HA1-3) . Este constructo comprende la cabeza globular de HA pero carece de la lámina β localizada por debajo en la estructura tridimensional de rayos X.

El constructo descrito por Jeon et al. induce una respuesta humoral e inmunitaria de linfocitos T auxiliares específica en ratones. Los anticuerpos generados tras la inmunización con ese constructo pueden reconocer también el virus intacto (pág. 170 y Fig. 2A) y muestran reactividad cruzada con otras dos cepas de la gripe (Fig. 2B) .

Se evaluó la protección frente a la infección por exposición a una dosis subletal de virus de la gripe 4 días después de la última inmunización. Se sacrificaron los ratones 5 días después y se determinó la presencia de virus infecciosos en los pulmones. Se determinó que el nivel de protección era de aproximadamente un 80 %, en comparación con ratones no inmunizados (pág. 172 y Fig. 7) .

Sumario de la invención La presente invención se refiere a composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria protectora y a métodos de preparación de proteínas que estimulan una repuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

El método de la invención se da en las reivindicaciones 1 a 14 y 23. Las composiciones se definen en las reivindicaciones 15 a 23. Los usos médicos de la invención se definen en las reivindicaciones 24 a 26.

Se describe un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transformar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora procariótica y cultivar la célula hospedadora procariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transfectar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína a una célula hospedadora eucariótica, en el que la célula hospedadora eucariótica no es una célula hospedadora eucariótica de Pichia pastoris y cultivar la célula hospedadora eucariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transfectar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína a una célula hospedadora eucariótica, en el que la célula hospedadora eucariótica no es una célula hospedadora eucariótica de Drosophila melanogaster y cultivar la célula hospedadora eucariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transfectar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína a una célula hospedadora eucariótica, en el que la célula hospedadora eucariótica no es una célula hospedadora eucariótica de insecto y cultivar la célula hospedadora eucariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transfectar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína a una célula hospedadora eucariótica, en el que la célula hospedadora eucariótica no es una célula hospedadora de insecto transformada establemente y cultivar la célula hospedadora eucariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, que comprende las etapas de separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural para formar así una porción de proteína, en el que la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y en el que la porción de proteína carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático; transfectar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora eucariótica, en el que la célula hospedadora eucariótica no es una célula hospedadora eucariótica de Pichia pastoris ni una célula hospedadora de insecto transfectada establemente y cultivar la célula hospedadora eucariótica para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.

Se describe también un método de estimulación de la inmunidad protectora en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye una... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de una proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora ante el virus de la gripe en un sujeto, que comprende:

a) separar una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural, en la que:

la porción de proteína incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que tiene al menos una lámina β en la parte inferior de la cabeza globular, que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático;

b) transformar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora procariótica;

c) cultivar la célula hospedadora para preparar así la proteína que estimula una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto, y

d) fusionar al menos una porción de una flagelina con la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural o ligar operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica la flagelina con una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural, en la que la flagelina activa el receptor de tipo Toll 5 (TLR5) .

2. El método de la reivindicación 1, en el que la porción de proteína carece además de una secuencia señal.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la porción de proteína incluye además:

a) al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en un puente salino, una cremallera de leucina, un dedo de cinc o al menos una hélice α; o b) al menos un enlace disulfuro; o c) al menos dos enlaces disulfuro; o d) al menos cuatro enlaces disulfuro; o e) al menos cinco enlaces disulfuro; o f) al menos seis enlaces disulfuro.

4. El método de la reivindicación 1, que incluye además la etapa de sustituir por una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un residuo aminoacídico seleccionado del grupo consistente en un residuo aminoacídico hidrófilo, un residuo aminoacídico polar y un residuo aminoacídico neutro una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un residuo aminoacídico hidrófobo en la porción de proteína.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el residuo aminoacídico hidrófobo incluye al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en un residuo de fenilalanina, un residuo de triptófano y un residuo de tirosina. o el residuo aminoacídico polar incluye al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en un residuo de ácido aspártico y un residuo de ácido glutámico.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la hemaglutinina vírica incluye: a) una proteína hemaglutinina vírica de la gripe; o b) una proteína hemaglutinina vírica de la gripe A; o c) una proteína hemaglutinina vírica de la gripe A, en la que la gripe A es al menos un miembro

seleccionado del grupo consistente en H1, H2, H3, H5, H7 y H9 de gripe A; o d) una proteína hemaglutinina vírica de la gripe B; o e) una proteína hemaglutinina vírica de la gripe C.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora procariótica a) es una célula hospedadora procariótica de E. coli; o b) es una célula hospedadora procariótica de Pseudomonas; o c) es una célula hospedadora procariótica de Bacillus; o

d) es una célula hospedadora procariótica de Salmonella.

8. El método de la reivindicación 1, que incluye además la etapa de insertar un ligador aminoacídico entre la flagelina y la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la flagelina

i) carece de al menos una porción de una región de bisagra; o ii) incluye al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en flagelina de Salmonella typhimurium,

flagelina de E. coli, flagelina de S. muenchen, flagelina de Yersinia, flagelina de Campylobacter, flagelina de P.

aeruginosa y flagelina de L. monocytogenes; o iii) incluye al menos un residuo de cisteína.

10. El método de la reivindicación 1, que incluye además la etapa de:

a) ligar operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína portadora con la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural; o b) ligar operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína portadora con la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural; y la proteína portadora es al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en toxoide del tétanos, toxoide de Vibrio cholerae, toxoide de difteria, mutante reactivo cruzado de toxoide de difteria, una subunidad B de una enterotoxina termolábil de E. coli, una proteína de cubierta del virus de mosaico del tabaco, una proteína de envoltura del virus de la rabia, una glucoproteína de envoltura del virus de la rabia, una tiroglobulina, una proteína de choque térmico 60, una hemocianina de lapa bocallave y un antígeno de tuberculosis secretado tempranamente 6; o c) eliminar al menos un sitio de glucosilación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural, y en cuyo caso opcionalmente el sitio de glucosilación incluye un sitio de N-glucosilación.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la hemaglutinina vírica de origen natural incluye la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la porción de proteína incluye la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48

o la SEQ ID NO: 50.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural no está glucosilada.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural incluye una porción HA1-1 de la hemaglutinina vírica de gripe de origen natural o una porción HA1-2 de la hemaglutinina vírica de gripe de origen natural.

15. Una composición para estimular una respuesta inmunitaria protectora ante virus de la gripe, que comprende una fusión de una flagelina o al menos una porción de la flagelina, en la que la flagelina activa el receptor de tipo Toll 5 (TLR5) , y una porción de proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural, en la que:

a) la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que tiene al menos una lámina β en la parte inferior de la cabeza globular, que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático; o b) la porción de proteína de hemaglutinina vírica de origen natural no está glucosilada e incluye al menos una porción de una cabeza globular y al menos una porción de al menos una estructura secundaria que tiene al menos una lámina β en la parte inferior de la cabeza globular, que causa que la cabeza globular retenga esencialmente su estructura terciaria, y carece de un dominio de fusión con membrana, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

16. La composición de la reivindicación 15, que incluye además una proteína portadora.

17. La composición de la reivindicación 15, en la que la flagelina

a) incluye al menos un residuo de cisteína o b) incluye al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en flagelina de Salmonella typhimurium, flagelina de E. coli, flagelina de S. muenchen, flagelina de Yersinia y flagelina de Campylobacter, flagelina de P. aeruginosa y flagelina de L. monocytogenes.

18. La composición de la reivindicación 15, en la que la hemaglutinina vírica de origen natural:

a) es una hemaglutinina vírica de la gripe A; o b) es una hemaglutinina vírica de la gripe B; o c) es una hemaglutinina vírica de la gripe C; o d) incluye la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.

19. La composición de la reivindicación 15, en el que la porción de proteína incluye las SEQ ID NO: 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 29, 40, 41, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 179, 180, 181 o 182.

20. La composición de la reivindicación 15, que incluye además al menos una porción de una proteína de matriz 2.

21. La composición de la reivindicación 15, en la que la flagelina carece de al menos una porción de una región de bisagra.

22. La composición de la reivindicación 15, en la que la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de origen natural incluye una porción HA1-1 de la hemaglutinina vírica de gripe de origen natural o una porción HA1-2 de la hemaglutinina vírica de gripe de origen natural.

23. El método o composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que la porción de proteína de la hemaglutinina vírica de gripe de origen natural incluye un péptido que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 70 %, una identidad de secuencia de aproximadamente un 80 %, una identidad de secuencia de aproximadamente un 85 % o una identidad de secuencia de aproximadamente un 90 % con al menos un miembro seleccionado del grupo consistente en las SEQ ID NO: 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 39, 40, 41, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 179, 180, 181 y 182.

24. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, para uso en terapia.

25. La composición de la reivindicación 24, en la que la composición estimula la inmunidad protectora frente al virus de la gripe.

26. Uso de la proteína preparada mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 15-25 para la fabricación de una vacuna para estimular la inmunidad protectora frente al virus de la gripe.

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8A Figura 8B Figura 8C Figura 9 Figura 10A Figura 10B Figura 11 Figura 12A Figura 12B Figura 13A Figura 13B Figura 13C Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 23 Figura 24 Figura 25 Figura 26 Figura 27 Figura 28

SEQ ID NO: 498 Secuencia aminoacídica de fljB/STF2 (región de bisagra subrayada)

Figura 29

SEQ ID NO 499: Secuencia de ácido nucleico de fljB/STF2 (región de bisagra subrayada)

Figura 30

SEQ ID NO: 502. Secuencia aminoacídica de fliC de E. coli (region de bisagra subrayada)

Figura 31

SEQ ID NO: 503. Secuencia de ácido nucleico de fliC de E. coli (region de bisagra subrayada)

Figura 32

SEQ ID NO: 504. Secuencia aminoacídica de flagelina fliC de Salmonella muenchen (región de bisagra subrayada)

Figura 33

SEQ ID NO: 505. Secuencia de ácido nucleico de flagelina fliC de Salmonella muenchen (región de bisagra subrayada)

Figura 34

SEQ ID NO: 506. Secuencia aminoacídica de pMT/STF2 (ligador subrayado)

Figura 35

SEQ ID NO: 507. Secuencia aminoacídica de pMT/STF2 (ligador subrayado)

Figura 36 Figura 37

Figura 38A Figura 38B

Figura 39

SEC ID NO: 585. Secuencia aminoacídica de pMT/STF2Δ

Figura 40

SEQ ID NO: 586. Secuencia de ácido nucleico de pMT/STF2Δ

Figura 41

Figura 42 Figura 43

Empalme de dominios I/III de proteína de envoltura de flavivirus (dominio .

28. 297, dominio II.

29. 406)

Figura 44 Figura 45

Figura 46 Figura 47 Figura 48

Flagelina de Pseudomonas aeruginosa (número de acceso P21184)

Figura 49

Secuencia de STF2

Figura 50

Flagelina de Listeria monocytogenes (número de acceso Q92DW3)

Figura 51