Composiciones que comprenden ligando de fucosa-manosa (FML) y saponina para la preparación de vacunas que bloquean la transmisión de la leishmaniasis en humanos y animales.

Una composición que comprende ligando de Fucosa-Manosa (FML) y saponina,

para su uso como vacuna bloqueante contra la transmisión de la leishmaniasis visceral canina, donde la administración de la composición a un sujeto canino produce un anticuerpo en dicho sujeto en respuesta a FML que inhibe la unión de promastigotes procíclcos de Leishmaniasis donovani y chagasi a la membrana del intestino medio de Phlebotominae, impidiendo de este modo la transmisión de la leishmaniasis por Phlebotominae a humanos y animales.

Composiciones que comprenden ligando de fucosa-manosa (FML) y saponina para la preparación de vacunas que bloquean la transmisión de la leishmaniasis en humanos y animales.

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica adecuada para la preparación de vacunas que bloquean la transmisión de leishmaniasis en humanos y animales, a partir de promastigotes de Leishmania y de fracciones de amastigotes de Leishmania. Dicha composición, cuando es administrada en combinación con un adjunvante de saponina, bloquea la transmisión de la leishmaniasis visceral en humanos y animales.

Antecedentes de la invención

En América y el Mediterráneo, la leishmaniasis, también llamada kala-azar, es una zoonosis canina. Cuando los insectos Phlebotominae se alimentan de cánidos salvajes adquieren el agente etiológico, transmitiéndolo mas tarde a los perros. La subsecuente transmisión a humanos por los insectos Phlebotominae causa Leishmaniasis visceral humana, una seria enfermedad que puede resultar fatal sino se la trata de modo adecuado.

Aproximadamente hay 1.. de nuevas ocurrencias de kala-azar al año en el mundo. Una vacuna protectiva para la profilaxis contra la enfermedad en humanos no esta disponible. Los mejores resultados fueron logrados con vacunas experimentales de primera generación, las cuales inducen un 12% de protección, pero solo entre aquellas personas que convirtieron a positivo en tests intradermales para lisados de Leishmania luego de una completa vacunación. Aun hoy, la quimioterapia contra kala-azar es altamente toxica y no siempre efectiva.

Estos vectores son una zoonosis canina transmitida por insectos y presentan una reducción de la infección a través de la ingestión de anticuerpos anti-Leishmania presentes en suero de perros sometidos a una vacunación protectiva teniendo un gran impacto para la reducción de la incidencia de la enfermedad en humanos.

La patente brasileña PI932386 describe un producto llamado antígeno FML, o "Ligando fucosa-manosa" de Leishmania donovani que comprende un complejo glicoproteico del cual su porción de carbohidratos presenta un 1% de fucosa y un 47% de mañosa, justificando el nombre utilizado. Este complejo inhibe fuertemente la infección de macrófagos del peritoneo de ratón debida a promastigotes y amastigotes de L.donovani y es especie-especifica en el genero Leishmania. FML es fuertemente inmunogénico en ratones, hámsteres y conejos, estimulando una intensa producción de anticuerpos. Es antigénico en humanos y es reconocido por altos niveles de anticuerpos específicos.

El análisis bioquímico inicial de FML ha revelado que es un compuesto glicoproteico conteniendo un 29% de azucares neutros, un 44% de proteína, un 11% de fosfatos y trazas de hexamina compuestas por bandas de proteínas con pesos moleculares que van desde 9 a 95 kDa, algunas bandas presentan carbohidratos: 36 y 54 a 68 kDa. La parte glicídica de FML resalta la presencia de un 1% de fucosa y un 47% de mañosa. También fue posible observar la presencia de un 3% de glucosa, 12% de galactosa y trazas de xilosa.

El N-oligosacarido asociado a FML forma parte de una cadena ramificada de unidades alternantes de Manp 4-o, 3- o, Glc Nac 4-o asociadas; N-acetil glucosamina como punto de ramificación y fucopiranosa y manopiranosa como residuos terminales, u oligosacáridos lineares compuestos por unidades de Manp 4-o, 3-o y 2-o asociados, 2-o asociados, fucopiranosa y galactopiranosa como residuos terminales (Tesis presentada en UFRJ el 14 de abril de 1998 por Robson R.Bernardo).

El análisis de los aminoácidos de FML ha revelado la presencia de acido glutámico, alanina, acido aspartico y glicina en cantidades que van desde 2 a 1%, serina, histidina, lisina, leucina, treonina, prolina y valina entre un 5 y un 1% y arginina, metionina, isoleucina, tirosina y fenilalanina entre un 2 y un 5%.

La disertación para obtener el grado de Master "Estudios de la glicoproteína GP36 y su potencial en la vacunación contra kala-azar experimental", presentada en la UFRJ por Edilma Paraguai de Souza identifica una glicoproteína de un peso molecular de 36 kDa como el antígeno predominante de FML, llamado GP36. En Acta Trópica, 53:59-72 se hicieron estudios sobre Leishmania donovani que confirman que GP36 es reconocida por el suero hiperinmune de ratón producido contra FML total. Los anticuerpos monoclonales obtenidos en contra de FML reconocen en gran medida a GP36. La antigenicidad de GP36 fue susceptible al tratamiento con periodato de sodio, indicando la naturaleza glicidica del epítope envuelto en la reacción con los anticuerpos monoclonales, (anticuerpo ACE1), confirmando su naturaleza glicoproteica. Más aun la disertación para obtener el grado de Master presentada a la UFRJ el 25 de marzo de 1988 por Emilse de Souza, muestra que esta fracción posee entre sus aminoácidos, de 1 a 2% de acido aspartico, acido glutámico, alanina y leucina, entre 5 y 1% de glicina, treonina, valina y lisina, y entre 2 y 5% de serina, histidina, arginina, prolina ,tirosina, metionina, isoleucina y fenilalanina y que su N- oligosacarido revela residuos de fucosa con dos tipos de sustitución (2,3-Me2-fucosa, 2,4-Me2 -fucosa) y

predominancia de residuos de manopiranosa del tipo 2, 3, 6-Me3-manosa, además de tri-Me3-galactosa correspondientes a cadenas lineares de manopiranosa 4-o sustituidas con sustituciones 3-o y residuos 4-o de fucopiranosa.

La anteriormente mencionada Acta Trópica también revela que no existe reactividad cruzada entre FML y la 5 glicoproteína 63, GP 63, previamente aislada de Leishmania. Los anticuerpos monoclonales específicos L 3.2 y L 3.9 obtenidos por David Russel contra GP63 no desarrollaron ninguna reacción con FML, ni en ensayos de Western Blot, ni en ensayos tipo ELISA, siendo considerado este último más sensible. Este resultado es previsible y coherente considerando los diferentes métodos de extracción. La extracción acuosa de FML, incluyendo un doble calentamiento a 1°C privilegia que la obtención de glicoconjugados de los cuales su fracción glicídica es 1 resistente a esas condiciones.

La porción proteica de GP 36 fue recientemente clonada en E.coli de acuerdo al sistema mencionado en "Molecular and Biochemical Parasitology", 12:315-319. Es una nucleósido hidrolasa de 34 kDa de L.donovani que posee un 75% de identidad con la uridín inosina hidrolasa (lUNH) de Crithidia Fasciculata y un 9 % de homología con la rNH (IUNH) de L.major. La nucleósido hidrolasa de L.donovani es un marcador específico para la diagnosis de kala-azar 15 en perros, como se describe en esa publicación. La secuencia de bases y aminoácidos de la nucleósido hidrolasa de L donovani, descripta en la Tesis de Doctorado "Molecular cloning of L donovani antigen GP 36" presentada en la UFRJ el 14 de mayo del 22, se muestra a continuación.

ATGCCGCGCAAGATTATTCTCGATTGTGATCCCGGGA7m47X3ATGCCGTGGCCATCTTTCTCGC

CCACGGCAACCCGGAGGTCGAG 87

MPRKIILDCDPGIDDAVAIFLAHGNPEVE

CTGCTGGCCATTACGACGGTGGTGGGCAACCAGACCCTGGAGAAGGTGACCCGGAACGCGCGG

CTGGTAGCTGACGTAGCCGGCATC 174

LLAITTVVG NQTLEKVTRNARLVADVAGI

GTTGGTGTGCCCGTCGCGGCTGGTTGCACCAAGCCCCTCGTGCGCGGTGTGCGGAATGCCTCTC

AGATTCATGGCGAAACCGGCATG 261

VGVPVAAGCTKPLVRGVRNASQIHGETGM

GGTAACGTCTCCTACCCACCAGAGTTCAAGACAAAGTTGGACGGCCGTCATGCAGTGC4GC7V3A TCATCGACCTTATCATGTCGCAC 348

GGTAACGTCTCCTACCCACCAGAGTTCAAGACAAAGTTGGACGGCCGTCATGCAGTGCAGC7,GA

TCATCGACCTTATCATGTCGCAC 348

GNVSYPPEFKTKLDGRHAVQLIIDLIMSH

GAGCCGAAGACGATCACGCTrGTGCCTACGGGTGGCCTGACGAACATTGCGATGGCTGTCCGTC

TTGAGCCGCGCATCGTGGACCGT 435

EPKTITLVPTGGLTNIAMAVRLEPRIVDR

GTGAAGGAGGTGGTTCTGATGGGTGGCGGCTACCATACTGOTAATGCGTCCCCTGTAGCGGAGT

TCAACGTCTTCGTCGACCCGGAG 522

VKEVVLMGGGYHTGNASPVAEFNVFVDPE

GCGGCGCACATTGTGTTCAACGAGAGCTGGAACGTAACGATGGTGGGGCTGGAOCTAACGCAC

CAGGCACTCGCCACGCCGGCGGTC 69

AAHIVFNESWNVTMVGLDLTHQALATPAV

CAGAAGCGAGTGAAGGAGGTGGGCACGAAGCCGGCTGCCTTCATGCrGCAGATTTTGGACmT

ACACGAAGGTGTACGAAAAGGAG 696 QKRVKEVGTKPAAFMLQILDFYTKVYEKE

CGCAACACGTACGCGACGGTGCACGATCCCTGCGCTGTGGCGTACGTGATTGACCCCACCGTGA

TGACGACGGAGCAAGTGCCAGTG 783

RNTYATVHPCAVAYVID PTVMTTEQVPV

GACATCGAGCTCAATGGGGCACTGACGACTGGGATGACGGTCGCGGACTTCCGCTACCCACGGC

CAAAGCACTGCCACACGCAGGTG 87

DIELNGALTTGMTVADFRYPRPKHCHTQV

GCTGTGAAGCTGGACTTCGACAAGTTTTGGTGCCTCGTGATTGACGCACTCAAGCGCATCGGCG ÁTCCTC A A TG A 94

AVKLDFDKFWCLVIDALKRIGDPQ

Un segundo componente antigénico de FML es una glicoproteína de 55 kDa, reconocida por 7 anticuerpos monoclonales tipo IgM y solo uno del tipo IgG es mencionado en Acta Trópica.

Descripción de la Invención

La presente invención... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende ligando de Fucosa-Manosa (FML) y saponina, para su uso como vacuna bloqueante contra la transmisión de la leishmaniasis visceral canina, donde la administración de la composición a un sujeto canino produce un anticuerpo en dicho sujeto en respuesta a FML que inhibe la unión de promastigotes

procíclcos de Leishmaniasis donovani y chagasi a la membrana del intestino medio de Phlebotominae, impidiendo de este modo la transmisión de la leishmaniasis por Phlebotominae a humanos y animales.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende además vehículos farmacológicos adecuados.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el FML comprende un complejo de glucoproteína que contiene 1 un 29 % de azúcares neutros, un 44 % de proteínas, un 11 % de fosfato y trazas de hexoaminas compuestas por

bandas de proteína con un peso molecular en el intervalo de 9 a 95 kDa, conteniendo algunas bandas de proteína carbohidratos: 36 y 54 a 68 kDa, presentando la porción glucídica de FML un 1 % de fucosa y un 47 % de mañosa, un 3 % de flucosa, un 12 % de galacosa y trazas de xilosa, aminoácidos que contienen entre un 1 a 2 % de ácido glutámico, alanina, ácido aspártico y glicina, del 5 al 1 % de serina, histidina, lisina, leucina, treonina, prolina 15 y valina y del 2 al 5 % de arginina, metionina, isoleucina, tirosina y fenilalanina.