Composición que comprende dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos para uso en el tratamiento de revascularización incompleta del miocardio después de un injerto de derivación de la arteria coronaria.

Una composición la invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la revascularización incompleta del miocardio en un sujeto que ha tenido un injerto de derivación de la arteria coronaria,

pero ha habido una revascularización incompleta del miocardio, comprendiendo la composición dos o más isoformas de HGF o uno o más polinucleótidos que codifican las isoformas como ingredientes activos, en donde dichas dos o más isoformas de HGF se seleccionan del grupo que consiste en HGF completo (flHGF), variante por deleción de HGF (dHGF), NK1, NK2 y NK4.

Composición que comprende dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos para uso en el tratamiento de revascularización incompleta del miocardio después de un injerto de derivación de la arteria coronaria

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a métodos para tratar o prevenir afecciones cardiacas en un sujeto que comprenden administrar al sujeto dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). La presente descripción se refiere adicionalmente a métodos para promover el crecimiento de células endoteliales en un vaso sanguíneo que comprenden administrar al vaso sanguíneo dos o más isoformas del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En una realización, las dos o más isoformas de HGF se administran en forma de uno o más polinucleótidos que codifican las isoformas.

Antecedentes de la invención

El HGF es una glicoproteína de unión a heparina también conocido como factor de dispersión o hepatopoyetina A. Originalmente identificado como un factor de crecimiento hepatotrófico potente (Nakamura et al., Nature 342: 44 (1989)), el HGF es una proteína de unión a heparina derivada del mesénquima que tiene múltiples efectos biológicos, tales como mitogénesis, motogenesis y morfogénesis de diversos tipos de células. Un gen que codifica el HGF se localiza en el cromosoma 7q21.1 y comprende 18 exones y 17 intrones, que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (Seki T., et al., Gene 12. 213-219 (1991)). Un transcrito de aproximadamente 6 kb se transcribe a partir del gen de HGF, y a continuación se sintetiza a partir de ahí un polipéptido precursor de HGF completo (flHGF) que consiste en 728 aminoácidos, que comprende los siguientes dominios: bucle de horquilla N- terminal-kringle1-kringle2-kringle3-kringle4-dom¡nio de serina proteasa inactivado. Al mismo tiempo, se sintetizan otras varias isoformas del polipéptido HGF mediante corte y empalme alternativo del gen de HGF. Las isoformas conocidas incluyen la variante por deleción de HGF (HGF completo excepto por una deleción de cinco residuos en kringlel), NK1 (bucle de horquilla N-terminal kringlel), NK2 (bucle de horquilla N-terminal kringlel-kringle2), y NK4 (bucle de horquilla N-terminal kringlel-kringle2-kringle3-kringle4). Además, existen variantes alélicas de cada isoforma. Los precursores biológicamente inactivos se pueden convertir en formas activas de heterodímero unido por enlaces disulfuro por una proteasa en el suero. En los heterod(meros, la cadena alfa que tiene un peso molecular elevado forma cuatro dominios kringle y un bucle de horquilla N-terminal como una región peptídica preactivada de plasminógeno. Los dominios kringle de una estructura de bucles unidos por tres enlaces disulfuro que consiste en aproximadamente 8 aminoácidos pueden jugar un papel importante en la interacción proteína-proteína. La cadena beta de bajo peso molecular forma un dominio de tipo serina proteasa inactivo. El dHGF que consiste en 723 aminoácidos es un polipéptido con una deleción de cinco aminoácidos en el primer dominio kringle de la cadena alfa, es decir, F, L, P, S y S, debido al corte y empalme alternativo entre el exón 4 y el exón 5.

In vivo, se generan dos isoformas de HGF (flHGF que tiene 728 aminoácidos y dHGF que tiene 723 aminoácidos) por medio de corte y empalme alternativo entre el exón 4 y el exón 5. Aunque tanto flHGF como dHGF comparten varias funciones biológicas, son diferentes en términos de propiedades inmunológicas y varias propiedades biológicas.

Se ha demostrado que el HGF estimula la angiogénesis mediante la regulación del crecimiento de las células endoteliales y la migración de células musculares lisas vasculares. Debido a su actividad angiogénica, el HGF es considerado como uno de los candidatos prometedores en la angiogénesis terapéutica. "Angiogénesis terapéutica" se refiere a una intervención que utiliza factores angiogénicos, ya sea en forma de proteínas recombinantes o en forma de genes, para el tratamiento de enfermedades isquémicas, tales como la enfermedad arterial coronaria (EAC), o la enfermedad arterial periférica (EAP). También se sabe que el HGF estimula no solo el crecimiento sino también la migración de las células endoteliales (Bussolino et al., J Cell Biol. 119: 629 (1992); Nakamura et al., J Hypertens 14: 167 (1996).), y se ha sometido a ensayo para determinar su papel como agente estimulador de la reendotelización (Yasuda et al., Circulation 11: 2546 (2); Hayashi et al., Gene Ther 7: 1664 (2)).

El HGF se ha utilizado como agente para la angiogénesis terapéutica. Morishita et al., han utilizado el gen de HGF para el tratamiento de EAP y EAC. Observaron cierta respuesta terapéutica para EAP después de administrar el gen de HGF, pero no estuvo claro si la transferencia del gen de HGF fue eficaz para el tratamiento de EAC. Hasta la fecha, la transferencia del gen de HGF se ha sometido a ensayo en varios modelos animales para EAC (Miyagawa et al., Circulation 15: 2556 (22); Azuma et al., Gene Ther. 13: 126 (26); Aoki et al., Gene Ther 7: 411 (2); Funatsu et al., J. Thoracic Cardiovasc Surg 124: 199 (22)). Sin embargo, todavía existe controversia sobre si la transferencia del gen de HGF tiene efectos beneficiosos sobre EAC. Por ejemplo, Miyagawa et al., demostraron que la transferencia de HGF humano no pudo aumentar la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) del corazón infartado 8 semanas después del tratamiento en un modelo de infarto de miocardio de rata (Miyagawa et al., Circulation 15: 2556 (22), Figura 2). Por otra parte, la transferencia del gen de HGF tuvo poco efecto sobre el porcentaje de acortamiento de la fracción y el grosor de la pared anterior del VI 8 semanas después del tratamiento en el mismo modelo (Miyagawa et al., Circulation 15: 2556 (22), Figuras 3 y 5).

El HGF también se ha utilizado como agente para inhibir la reestenosis. Los procedimientos de angioplastia coronaria, p. ej., con balón o implante endoluminal, son métodos ampliamente utilizados para el tratamiento de los vasos sanguíneos oscurecidos. Sin embargo, el engrosamiento de la íntima, p. ej., la reestenosis de la arteria coronaria plantea un problema significativo cuando se utiliza la angioplastia. Una de las causas de la reestenosis es la hiperproliferación y migración de células musculares lisas vasculares con el acompañamiento de síntesis de matriz extracelular, como resultado de una respuesta a la lesión del vaso. Existe evidencia de que la rápida renovación endotelial podría suprimir la proliferación de células musculares lisas, y de ese modo inhibir la reestenosis (p. ej., Bauters et al., Prog Cardiovasc Dis. 4: 17 (1997)). Como un método para la prevención de la reestenosis, se intentó la administración local de factores de crecimiento endotelial tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) al vaso sanguíneo lesionado y mostró efectos sobre la atenuación de la reestenosis (Asahara et al., Circulación 94: 3291 (1996); Yasuda et al., Circulation 11: 2546 (2); Hayashi et al., Gene Ther. 7: 1664 (2); Walter et al., Circulation 11: 36 (24)). Todos los estudios sobre la terapia génica con HGF descritos anteriormente se han realizado con el ADNc de flHGF que codifica 728 aminoácidos, pero no con ADNc de dHGF que codifica 723 aminoácidos (Miyagawa et al.; Azuma et al.; Aoki et al.; Funatsu et al.; Yasuda et al.; y Hayashi et al.).

Hahan W., et al., Molecular Therapy 26, vol. 13 (Sup. 1), P876 describen experimentos para evaluar el potencial terapéutico del híbrido de HGF HGF-X7, en un modelo de enfermedad de extremidad isquémica de conejo y un modelo de enfermedad de corazón isquémico de rata.

El documento US 25/79581 describe un gen de HGF híbrido y su uso para el tratamiento o la prevención de enfermedades isquémicas o del hígado.

Jayasankar, V., et al., Circulation, 23, vol. 18 (Sup. II), II-23 - II-236 describen que la transferencia génica de HGF al miocardio de ratas atenúa la insuficiencia cardíaca post-infarto después de la ligación de la arteria coronaria descendente anterior izquierda.

Sagakuchi, G., et al., Annals of Thoracic Surgery, 25, Vol. 79, 1626-1634 describen que el HGF liberado de manera controlada previene el progreso de la insuficiencia cardíaca en ratas hipertensas espontáneamente propensas al ictus.

La presente invención proporciona la primera demostración de que la transferencia de secuencias de nucleótidos que expresan múltiples isoformas de HGF (p. ej., flHGF y dHGF) puede tratar eficazmente la EAC en animales y seres humanos, en comparación con el ADNc para flHGF que se había sometido a ensayo en la mayoría de los informes anteriores. La presente invención también... [Seguir leyendo]

1. Una composición la invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la revascularización incompleta del miocardio en un sujeto que ha tenido un injerto de derivación de la arteria coronaria, pero ha habido una revascularización incompleta del miocardio, comprendiendo la composición dos o más isoformas de HGF o uno o más polinucleótidos que codifican las isoformas como ingredientes activos, en donde dichas dos o más isoformas de HGF se seleccionan del grupo que consiste en HGF completo (flHGF), variante por deleción de HGF (dHGF), NK1, NK2 y NK4.

2. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde el sujeto necesita tratamiento de reestenosis.

3. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dichas dos o más isoformas de HGF se administran en forma de polinucleótidos que codifican las isoformas.

4. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha composición se administra mediante inyección.

5. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha composición se administra utilizando un dispositivo de suministro, y preferiblemente en donde dicho dispositivo de suministro es un implante endoluminal.

6. La composición para su uso de la reivindicación 5, en donde dicho implante endoluminal se selecciona del grupo que consiste en un implante endoluminal de acero inoxidable no basado en polímero, un implante endoluminal de acero inoxidable con una base de polímero, un implante endoluminal de cobalto-cromo no basado en polímero, y un implante endoluminal de cobalto-cromo con una base de polímero.

7. La composición para su uso de la reivindicación 5, en donde dicha composición se libera de dicho implante endoluminal.

8. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde dichas dos o más isoformas de HGF comprenden HGF completo (flHGF) y variante por deleción de HGF (dHGF).

9. La composición para su uso de la reivindicación 8, en donde dichas dos o más isoformas de HGF comprenden adicionalmente NK1.

1. La composición para su uso de la reivindicación 8, en donde dichas dos o más isoformas de HGF consisten en flHGF y dHGF.

11. La composición para su uso de la reivindicación 8, en donde dichos flHGF y dHGF son cada uno idénticos al menos en 8%, preferiblemente al menos 9%, o preferiblemente al menos 95% a la secuencia de tipo salvaje de flHGF humano y dHGF humano.

12. La composición para su uso de la reivindicación 11, en donde dichos flHGF y dHGF son flHGF humano y dHGF humano.

13. La composición para su uso de la reivindicación 8, en donde dicho flHGF y dicho dHGF están codificados por polinucleótidos separados o están codificados por el mismo polinucleótido.

14. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde dichos uno o más polinucleótidos están conectados operablemente a un promotor, y preferiblemente a un promotor constitutivo.

15. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde dichos uno o más polinucleótidos están en diferentes vectores.

16. La composición para su uso de la reivindicación 1, en el que dicho uno o más polinucleótidos en el mismo vector.

17. La composición para su uso de la reivindicación 16, en donde dicho vector es un vector viral o un vector plasmídico, preferiblemente un vector pCK.

18. La composición para su uso de la reivindicación 8, en donde dicho flHGF y dicho dHGF están codificados por un constructo de HGF híbrido que comprende los exones 1-18 de HGF o productos degenerados de los mismos que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada y que comprende adicionalmente un intrón entre los exones 4 y 5, en donde dicho constructo está desprovisto de otros intrones entre los exones distintos de dicho intrón entre los exones 4 y 5.

19. La composición para su uso de la reivindicación 18, en donde dicho intrón es un intrón inherente, y preferiblemente en donde dicho constructo de HGF híbrido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

2. La composición para su uso de la reivindicación 18, en donde dicho intrón es un fragmento de un intrón inherente, y preferiblemente en donde dicho constructo de HGF híbrido comprende la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 8, 9, 1.

21. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un ser humano y dichas isoformas 5 de HGF se administran a una dosis de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 1 mg cada una.

22. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un ser humano y dichos polinucleótidos se administran a una dosis de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 1 mg.

23. Un uso de una composición que comprende dos o más isoformas de HGF o uno o más polinucleótidos que codifican las isoformas para la fabricación de un medicamento para tratar la revascularización incompleta del

miocardio en un sujeto que ha tenido un injerto de derivación de la arteria coronaria, pero ha habido una revascularización incompleta del miocardio, en donde dichas dos o más isoformas se seleccionan del grupo que consiste en HGF completo (flHGF), variante por deleción de HGF (dHGF), NK1, NK2 y NK4.