Composición inmunógena para uso en vacunación contra estafilococos.

Una composición inmunógena que comprende:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo;

- SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo;

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V de S. aureus; y

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo VIII de S. aureus.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo de las composiciones inmunógenas y vacunas contra estafilococos, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una combinación de antígenos para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos. También se proporcionan procedimientos de uso de dichas vacunas en medicina y procedimientos para su preparación.

Antecedentes

El número de infecciones adquiridas en la comunidad y adquiridas en el hospital ha aumentado en los últimos años con el creciente uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones adquiridas en el hospital (nosocomiales) son una causa principal de morbididad y mortalidad, más particularmente en EE.UU., donde afecta a más de 2 millones de pacientes anualmente. Siguiendo varios estudios, aproximadamente el 6 por ciento de los pacientes de EE.UU. adquirirá una infección durante su estancia en el hospital. La carga económica en EE.UU. se estimó en más de 4,5 billones de dólares americanos en 1992 (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (ITU, 33 % de las infecciones), seguidas de neumonía (15,5 %), infecciones en el área quirúrgica (14,8 %) e infecciones primarias en la circulación sanguínea (13 %) Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).

Los patógenos nosocomiales pricipales son Staphylococcus aureus, estafilococos negativos a la coagulasa (principalmente Staphylococcus epidermidis), Enterococcus spp, Esherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque dichos patógenos casi producen el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producir junto con la frecuencia de los aislados resistentes a antibióticos cuadran esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más significativos.

Staphylococcus aureus es la causa más frecuente de infecciones nosocomiales con una morbididad y mortalidad significativa (Romero-Vivas et al. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos y síndrome del shock tóxico.

S. epidermidis es un comensal normal de la piel que también es un patógeno oportunista importante responsable de infecciones de dispositivos médicos implantados y de infecciones en las zonas de cirugía. Los dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluyen marcapasos cardíacos, derivaciones de líquido cefalorraquídeo, catéteres para diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardíacas protésicas.

Las infecciones producidas por S. aureus y S. epidermidis se tratan con antobióticos con la penicilina siendo el fármaco de elección, mientras que la vancomicina se usa para los aislados resistentes a meticilina. El porcentaje de cepas de estafilococos que exhiben resistencia de amplio espectro a los antibióticos se ha convertido en cada vez más prevalente desde la década de 1980 (Panlilo et al. 1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), suponiendo una amenaza para la terapia antimicrobiana eficaz. Además, la reciente aparición de la cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha aumentado el miedo de aparición y avance de cepas de S. aureus resistentes a meticilina para las que no se dispone de un tratamiento eficaz.

Se ha investigado un enfoque alternativo del uso de anticuerpos contra antígenos de estafilococos en la inmunoterapia pasiva. Se esta desarrollando una terapia que implica la administración de antisueros policlonales (documentos WO 00/15238, WO 00/12132) así como el tratamiento con un anticuerpo monoclonal contra el ácido lipoteicoico (documento WO 98/57994).Un enfoque alternativo sería el uso de la vacunación activa para generar una respuesta inmunitaria contra estafilococos. Se han identificado varios candidatos para incluir como componentes de la vacuna. Estos incluyen proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), análogo del MHC II (documento US5648240), proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), GehD (documento US 2002/0169288), proteína de unión a colágeno (documento US6288214), SdrF, SdrG y SdrH (documento WO 00/12689), SEA mutante y exotoxinas de SEB (documento WO 00/02523) y la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852). También se han desarrollado vacunas de múltiples componentes que comprenden determinadas combinaciones de proteínas de unión bacterianas ("MSCRAMM") (documento US6703025). Entre las realizaciones divulgadas en el documento US6703025 se encuentran las composiciones que comprenden el factor de agrupamiento A ("ClfA") o el factor de agrupamiento B ("CLfB").

Se ha secuenciado el genoma de S. aureus y se han identificado muchas de las secuencias de codificación (documentos EP786519, WO02/094868). Lo mismo es cierto para S. epidermidis (documento WO 01/34809). Como un perfeccionamiento de este abordaje, otros han identificado proteínas que son reconocidas por suero hiperinmunitario de pacientes que han sufrido una infección por estafilococos (documentos WO01/98499, WO 02/059148).

La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteínas que produce ha tenido un

éxito limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Existe la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones producidas por estafilococos.

De acuerdo con ello la presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y

- SitC aislado o o un fragmento inmunógeno del mismo;

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V de S. aureus', y

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo VIII de S. aureus.

Descripción de las figuras

Figura 1 - Secuencias polipeptídicas de proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína está representada por cada SEC ID.

Figura 2 - Secuencias nucleotídicas que codifican proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína está codificada por cada SEC ID.

Figura 3. Purificación de la toxina alfa en condiciones nativas. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Calle 1- marcadores de peso molecular, calle 2 - fracción soluble que contiene la toxina alfa sobreexpresada, calle 3 - flujo que atraviesa la columna de Ni-NTA, calle 4 - fracciones eluidas con 10 % de tampón B, calle 5 - fracciones eluidas con 20 % de tampón B, calle 6 - fracciones eluidas con 30 % de tampón B, calle 7 - fracciones eluidas con 50 % de tampón B,

calle 8 - fracciones eluidas con 75 % de tampón B, calle 9 y calle 10 fracciones eluidas con 100 % de tampón B,

calle 11 bacterias a T= 0 antes de la inducción, calle 12 - bacterias a T= 4 horas tras la inducción, calle 13 - lisado celular, calle 14 - fracción soluble, calle 15 - fracción insoluble.

El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 10, 5, 2 y 1 pl de la toxina alfa purificada.

Figura 4. Purificación de SdrC en condiciones desnaturalizantes. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Calle M- marcadores de peso molecular, calle Inicio- sobrenadante formado a partir de la fracción insoluble que contiene SdrC sobreexpresado, calle FT1- caudal a través de la columna de Ni-NTA, calle C- fracciones eluidas con tampón de lavado C, calle D- fracciones eluidas con tampón D, calle E - fracciones eluidas con tampón E. El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 1, 2, 5 y 10 pl del SdrC purificado.

Figura 5 - Resultados de ELISA de antisueros contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con proteínas purificadas.

Conjunto de ratones pre - resultado usando sueros combinados extraídos de ratones antes de la inoculación. Conjunto de ratones Post III - resultado usando sueros de ratón combinados extraídos después de la inmunización. Conjunto de conejos pre - resultado usando sueros combinados extraídos de conejos antes de la inoculación. Conjunto de conejos Post III - resultado usando sueros de conejo combinados extraídos después de la Inmunización. Ble- Control negativo.

Figura 6 - Resultados de ELISA de antisueros de ratón producidos contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 5. El panel B usa placas revestidas con células enteras... [Seguir leyendo]

1. Una composición ¡nmunógena que comprende:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo;

- SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo;

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V de S. aureus; y

- polisacárido u oligosacárido capsular de tipo VIII de S. aureus.

2. La composición ¡nmunógena de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un regulador estafilocócico aislado de virulencia o toxina, o un fragmento inmunógemo del mismo, en el que dicho regulador de virulencia o toxina está seleccionado del grupo que consiste en toxina alfa (Hla), mutante H35L de toxina alfa, mutante H35R de toxina alfa y proteína de activación de ARN III (RAP).

3. La composición ¡nmunógena de la reivindicación 1 o 2, que comprende al menos una proteína o fragmento inmunógeno de S. aureus.

4. La composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una proteína o fragmento inmunógeno de S. epidermidis.

5. La composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un polisacárido o un oligosacárido PIA.

6. La composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además polisacárido u oligosacárido capsular de tipo I y/o de tipo II y/o de tipo III de S. epidermidis.

7. La composición ¡nmunógena de la reivindicación 5 o 6, en la que el polisacárido capsular estafilocócico está conjugado con un vehículo proteico.

8. La composición ¡nmunógena de la reivindicación 7, en la que el vehículo proteico está seleccionado de toxoide del tétanos, toxoide diftérico, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina y toxoide alfa.

9. La composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de generar una respuesta inmunitaria eficaz tanto contra S. aureus como contra S. epidermidis.

10. Una vacuna que comprende la composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Un procedimiento de fabricación de una vacuna que comprende las etapas de mezclar antígenos para preparar la composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y añadir un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Uso de la composición ¡nmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por estafilococos.