Composición de anticuerpo genéticamente modificada.

Composición de anticuerpo IgG1 humano recombinante que tiene una mayor actividad citotóxica dependiente del complemento que un anticuerpo IgG1 humano y un anticuerpo IgG3 humano y que tiene actividad de unión a la proteína A,

que es sustancialmente igual a la de un anticuerpo IgG1 humano, en la que un polipéptido que comprende un dominio CH2 en la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano es sustituido por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la misma posición de un anticuerpo IgG3 humano indicada por el índice EU como en Kabat et al., en lo sucesivo denominado índice EU.

Composición de anticuerpo genéticamente modificada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición de anticuerpo recombinante que tiene una actividad citotóxica dependiente del complemento mayor que un anticuerpo lgG1 humano y un anticuerpo lgG3 humano, en la que un polipéptido que comprende un dominio CH2 en la reglón Fe de un anticuerpo lgG1 humano se sustituye por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la misma posición de un anticuerpo lgG3 humano indicado por el índice EU como en Kabat et al. (en lo sucesivo denominado índice EU); a un ADN que codifica la molécula de anticuerpo o una región constante de cadena pesada de la molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante; a un transformante obtenible introduciendo el ADN en una célula hospedadora; a un procedimiento para producir la composición de anticuerpo recombinante usando el transformante; y a un medicamento que comprende la composición de anticuerpo recombinante como ingrediente activo.

Antecedentes de la técnica

Puesto que los anticuerpos tienen actividad de unión elevada, especificidad de unión y estabilidad elevada en sangre, se han intentado sus aplicaciones a agentes de diagnóstico, preventivos y terapéuticos para diversas enfermedades humanas (documento 1 no de patente). Además, se han preparado anticuerpos quiméricos humanos o anticuerpos humanizados a partir de anticuerpos de animales no humanos usando técnicas de recombinación génica (documentos 2 a 5 no de patente). El anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo en el que su región variable es un anticuerpo de animal no humano, y su región constante es un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo en el que la región determinante de la complementariedad (en lo sucesivo denominada CDR) de un animal no humano se sustituye por CDR de un anticuerpo humano.

Los anticuerpos quiméricos humanos y los anticuerpos humanizados han resuelto problemas planteados por anticuerpos de ratón y similares, tales como la elevada inmunogenicidad, baja función efectora y corta semivida en sangre de anticuerpos de animales no humanos, y las aplicaciones de anticuerpos monoclonales a preparaciones farmacéuticas se hicieron posible mediante su uso (documentos 6 a 9 no de patente). En los Estados Unidos de América, por ejemplo, ya se han aprobado una pluralidad de anticuerpos humanizados como un anticuerpo para el tratamiento del cáncer, y en el mercado (documento 1 no de patente).

Estos anticuerpos quiméricos humanos y anticuerpos humanizados muestran realmente efectos hasta cierto grado a nivel clínico, pero se demandan anticuerpos terapéuticos que tienen mayores efectos. Por ejemplo, en el caso de la administración única de Rituxan (documento 11 no de patente) (fabricado por IDEC/Roche/Genentech), que es un anticuerpo quimérico humano contra CD2, se ha dado a conocer que su relación de respuesta para pacientes con linfoma no de Hodgkin de baja malignidad recurrente mediante el ensayo clínico de fase III no es mayor que 48% (remisión completa 6%, remisión parcial 42%), y su duración promedio de respuesta es 12 meses (documento 12 no de patente). En el caso del uso de la combinación de Rituxan y quimioterapia (CHOP: ciclofosfamida, doxorrubicina, vincrístina), se ha dado a conocer que su relación de respuesta para pacientes con linfoma no de Hodgkin de baja malignidad recurrente y folicular mediante el ensayo clínico de fase II es 95% (remisión completa 55%, remisión parcial 45%), pero se encontraron efectos secundarios debidos a CHOP (documento 13 no de patente). En el caso de la administración única de herceptina (fabricado por Genentech), que es un anticuerpo humanizado frente a HER2, se ha dado a conocer que su relación de respuesta para pacientes con cáncer de mama metastásico mediante el ensayo clínico de fase III es solo 15%, y su duración promedio de respuesta es 9,1 meses (documento 14 no de patente).

La molécula de anticuerpo humano también se denomina inmunoglobulina (en lo sucesivo denominada Ig), y se clasifica en clases respectivas de IgA, IgD, IgE, IgG e IgM basándose en su estructura molecular. La molécula de anticuerpo de IgG humana (en lo sucesivo denominada IgG) usada principalmente como el anticuerpo terapéutico está formada por dos polipéptidos respectivos denominados cadena pesada (en lo sucesivo denominada cadena H) y cadena ligera (en lo sucesivo denominada cadena L). La cadena H está formada por estructuras de dominio respectivas denominadas región variable de la cadena H (en lo sucesivo denominada VH), CH1, bisagra, CH2 y CH3, desde el lado N-terminal. Los dominios respectivos CH1, bisagra, CH2 y CH3 también se denominan reglón constante de la cadena pesada como un todo (en lo sucesivo denominada CH), y los dominios CH2 y CH3 también se denominan región Fe como un todo. La cadena L está formada por estructuras de dominio respectivas denominadas región variable de la cadena L (en lo sucesivo denominada VL) y región constante de la cadena L (en lo sucesivo denominada CL), desde el lado N-terminal.

En la cadena H del anticuerpo IgG existen cuatro subclases que incluyen lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Las cadenas H de subclases IgG respectivas tienen mutuamente alrededor de 95% de homología de secuencia de aminoácidos en la región constante, excluyendo la bisagra, que es rica en variabilidad (figura 1).

Independientemente de la homología elevada de secuencia de aminoácidos en subclases IgG respectivas, la altura de la actividad biológica poseída varía de ese modo (documento 15 no de patente). La actividad biológica incluye funciones efectoras tales como actividad citotóxica dependiente del complemento (en lo sucesivo denominada CDC), actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (en lo sucesivo denominada ADCC) y actividad fagocítica, y estas funciones desempeñan un papel importante en el organismo vivo, tal como la exclusión de materias extrañas y patógenos.

Una familia del receptor de Fcy (en lo sucesivo denominado FcyR) se expresa en la superficie de diversos leucocitos tales como célula asesina natural (en lo sucesivo denominada célula NK), monocito, macrófago y granulocito. El FcyR se clasifica en FcyR de tipo activo, que incluye FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa y FcyRIIIb, y FcyR de tipo supresión de FcyRIlb. Los anticuerpos IgG, particularmente lgG1 e lgG3 en seres humanos, se unen fuertemente a estos receptores y como resultado inducen actividad ADCC y actividad fagocítica por leucocitos.

La actividad ADCC es una reacción citolítica en la que un anticuerpo unido a su antígeno se une principalmente a FcyRIIIa en la superficie de células NK vía el resto Fe, y como resultado, la reacción se genera mediante moléculas citotóxicas, tales como perforina y granzima, liberadas a partir de la célula NK (documentos 16 y 17 no de patente). El grado de la actividad ADCC generalmente está en el orden de lgG1 > lgG3 » lgG4 > lgG2 (documentos 18 y 19 no de patente).

La actividad CDC es una reacción en la que un anticuerpo unido a su antígeno activa la cascada de reacciones de un grupo de proteínas séricas, denominadas sistema del complemento del suero, y finalmente lisa la célula diana. La actividad CDC es elevada en lgG1 e lgG3 humana, y el grado está generalmente en el orden de lgG3 lgG1 ^ IgG 2 = lgG4. El sistema del complemento se clasifica en componentes respectivos de C1 a C9, y la mayoría de ellos son precursores enzimáticos que expresan actividades enzimáticas mediante degradación parcial. La actividad CDC empieza con la unión de C1q como un componente de C1 a la región Fe de un anticuerpo en la célula diana, cada uno de los componentes subsiguientes se degrada parcialmente por el componente de la etapa previa para hacer avanzar la cascada de la activación, y finalmente, C5 a C9 forman un polímero formador de poros denominado complejo de ataque a la membrana en la membrana celular de la célula diana, para provocar la reacción de lisis celular (documentos 16 y 17 no de patente).

La Importancia de las funciones efectoras descritas anteriormente también se reconoce en el mecanismo de acción de anticuerpos terapéuticos usados en el campo clínico. El Rituxan descrito anteriormente es un anticuerpo quimérico humano de subclase lgG1, y no solo muestra actividad ADCC y actividad CDC in vitro (documento 21 no de patente) sino que también se ha sugerido en sus efectos clínicos que Rituxan ejerce realmente funciones efectoras en el cuerpo de los pacientes, debido al hecho de que su efecto terapéutico es elevado en pacientes que muestran un genotipo de actividad ADCC fuerte (documento 22 no de patente), que los componentes del complemento se consumen rápidamente de... [Seguir leyendo]

1. Composición de anticuerpo lgG1 humano recombinante que tiene una mayor actividad citotóxica dependiente del complemento que un anticuerpo lgG1 humano y un anticuerpo lgG3 humano y que tiene actividad de unión a la proteína A, que es sustancialmente igual a la de un anticuerpo lgG1 humano, en la que un polipéptido que comprende un dominio CH2 en la región Fe de un anticuerpo lgG1 humano es sustituido por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la misma posición de un anticuerpo lgG3 humano indicada por el índice EU como en Kabat et al., en lo sucesivo denominado índice EU.

2. Composición de anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en la que el polipéptido que comprende un dominio CH2 en la región Fe de un anticuerpo lgG1 humano que se va a sustituir es un polipéptido seleccionado de entre los siguientes (1) a (8):

(1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 34 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 356 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 358 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(4) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 384 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(5) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 392 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(6) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 397 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU;

(7) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 422 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU, y

(8) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos en las posiciones 231 a 434 y en las posiciones 436 a 447 de un anticuerpo lgG1 indicadas por el índice EU.

3. Composición de anticuerpo recombinante según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una molécula de anticuerpo que tiene cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico en la región Fe, en la que la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor de las cadenas de azúcar entre el total de las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico que se unen a la región Fe contenidas en la composición es de 2% o más.

4. Composición de anticuerpo recombinante según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una molécula de anticuerpo que tiene unas cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico en la región Fe, en la que las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico unidas a la región Fe del anticuerpo son cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el terminal reductor en las cadenas de azúcar.

5. ADN que codifica la molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante descrita en las reivindicaciones 1 o 2.

6. ADN que codifica la región constante de cadena pesada de la molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante descrita en las reivindicaciones 1 o 2.

7. Transformante obtenible introduciendo el ADN descrito en la reivindicación 6 en 1) una célula hospedadora aislada, o 2) una célula hospedadora no humana, en el que tanto para (1) como (2) la célula hospedadora no es una célula embrionaria humana.

8. Transformante según la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora es una célula resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N- acetilglucosamina en el terminal reductor a través de un enlace en la cadena de azúcar enlazada mediante enlaces N-glucosídicos.

9. Transformante según la reivindicación 7, en el que cuando se Introduce en la célula hospedadora un gen que codifica una molécula de anticuerpo, la célula hospedadora es capaz de producir una composición de anticuerpo que

comprende una molécula de anticuerpo que tiene unas cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico en la región Fe, en el que la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida a N- acetilglucosamina en el terminal reductor de las cadenas de azúcar entre el total de las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas mediante enlace N-glucosídico que se unen a la región Fe contenidas en la composición es de 2% o más.

1. Transformante según la reivindicación 9, en el que las cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida son cadenas de azúcar en las que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través de un enlace en la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N- glucosídico.

11. Transformante según la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora es una célula en la que se modifica un genoma para tener actividad disminuida o suprimida de una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, y/o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través de un enlace en la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico.

12. Transformante según la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora es una célula en la que todos los alelos en un genoma que codifican una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP- fucosa, y/o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través de un enlace en la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico están genosuprimidos.

13. Transformante según la reivindicación 11 o 12, en el que la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, es una enzima seleccionada de entre GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa (Fx).

14. Transformante según la reivindicación 13, en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por los siguientes (a) y (b):

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 18;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN que consiste en la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 18 en condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene actividad de GDP-manosa 4,6-deshidratasa.

15. Transformante según la reivindicación 13, en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por las siguientes (a) a (c):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 19;

(b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos está(n) suprimido(s), sustituido(s), insertado(s) y/o añadido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 19 y que tiene actividad de GDP-manosa 4,6-deshidratasa;

(c) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 8% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 19 y que tiene actividad de GDP-manosa 4,6- deshidratasa.

16. Transformante según la reivindicación 13, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por los siguientes (a) y (b):

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 2;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN que consiste en la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 2 en condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene actividad de GDP-4-ceto-6-desoxi-D- manosa-3,5-epimerasa.

17. Transformante según la reivindicación 14, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por las siguientes (a) a (c):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 21;

(b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos está(n) suprimido(s), sustituido(s), insertado(s) y/o añadido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 21 y que tiene actividad de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa;

(c) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 8% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 21 y que tiene actividad de GDP-4-ceto-6-desoxi-D- manosa-3,5-epimerasa.

18. Transformante según la reivindicación 11 o 12, en el que la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el terminal reductor a través de un enlace en la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante enlace N-glucosídico es 1,6- fucosiltransferasa.

19. Transformante según la reivindicación 18, en el que la 1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por los siguientes (a) y (d):

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 22;

(b) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°: 23;

(c) un ADN que se híbrida con el ADN que consiste en la secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°:

22 en condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa;

(d) un ADN que se híbrida con el ADN que consiste en una secuencia nucleotídica representada por SEC ID N°:

23 en condiciones restrictivas y que codifica una proteína que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa.

2. Transformante según la reivindicación 18, en el que la 1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por las siguientes (a) a (f):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 24;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 25;

(c) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos está(n) suprimido(s), sustituido(s), insertado(s) y/o añadido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 24 y que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa;

(d) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos está(n) suprimido(s), sustituido(s), insertado(s) y/o añadido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 25 y que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa;

(e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 8% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 24 y que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa;

(f) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 8% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 25 y que tiene actividad de 1,6-fucosiltransferasa.

21. Transformante según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 2, en el que la célula hospedadora es una célula seleccionada de entre el grupo constituido por las siguientes (a) a (i):

(a) una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino;

(b) una célula de línea celular de mieloma de rata, YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2;

(c) una célula de línea celular de mieloma de ratón, NSO;

(d) una célula de línea celular de mieloma de ratón, SP2/-Ag14;

(e) una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster sirio;

(f) una célula de hibridoma productora de anticuerpos;

(g) una célula de línea celular de leucemia humana, Namalwa;

(h) una célula madre embrionaria no humana;

(i) un óvulo fecundado no humano.

22. Procedimiento para producir una composición de anticuerpo recombinante, que comprende cultivar el transformante descrito según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 21 en un medio para formar y acumular la composición de anticuerpo en el cultivo; y recuperar y purificar la composición de anticuerpo a partir del cultivo.

23. Medicamento, que comprende la composición de anticuerpo recombinante descrita según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 4 como ingrediente activo.