Células diferenciadas adecuadas para tratamiento humano.

Una molécula de ácido nucleico que comprende la estructura P-X,

en la que:

X es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un producto que es letal para una célula en la que se expresa o hace una célula en la que se expresa susceptible de un efecto letal de un agente externo y P es un elemento de control transcripcional que produce que X se exprese preferiblemente en células madre pluripotentes de primate (pPS) no diferenciadas.

Células diferenciadas adecuadas para tratamiento humano.

Campo técnico

Esta invención se refiere en general a activar vectores víricos controlados. Más específicamente, describe una tecnología para retirar células no diferenciadas de poblaciones procedentes de células madre pluripotentes usando vectores líticos expresados de manera selectiva.

Antecedentes

Las células precursoras se han convertido en una preocupación principal en investigación médica. Muchos tejidos en el cuerpo tienen un depósito de reserva de precursores que pueden reemplazar células que son senescentes o están dañadas por lesión o enfermedad. Recientemente se ha realizado un considerable esfuerzo para aislar precursores de una serie de diferentes tejidos para uso en medicina regenerativa.

La Patente de EE UU. 5.75.397 (Tsukamoto et al., Systemix) indica aislamiento y crecimiento de células madre hematopoyéticas humanas que son Thy-1+, CD34+ y son capaces de diferenciación en linajes linfoides, eritroides y mielomonocíticos. La Patente de EE.UU. 5.736.396 (Bruder et al.) indica métodos para diferenciación dirigida al linaje de células madres mesenquimales humanas, aisladas, usando un factor bioactivo apropiado. Las células derivadas se pueden introducir después en un huésped para regeneración o reparación de tejido mesenquimal.

La Patente de EE UU. 5.716.411 (Orgill et al.) propone regenerar la piel en el sitio de una quemadura o herida, usando un autoinjerto epitelial. La Patente de EE.UU. 5.766.948 (F. Gage) indica un método para producir neuroblastos a partir de tejido cerebral animal. La Patente de EE.UU. 5.672.499 (Anderson et al.) indica obtener células madre de cresta neural de tejido embrionario. La Patente de EE.UU. 5.851.832 (Weiss et al., Neurospheres) indica aislamiento de células madre neurales putativas de fetos humanos de 8-12 semanas. La Patente de EE.UU. 5.968.829 (M. Carpenter) indica células madre neurales humanas procedentes de tejido del sistema nervioso central principal.

La Patente de EE.UU. 5.82.67 (F. Gage) indica un método para injertar células genéticamente modificadas para tratar defectos, enfermedad o daño del sistema nervioso central. Auerbach et al. (Eur. J. Neurosci. 12: 1.696, 2.) indican que las células del SNC multipotenciales implantadas en cerebros de animales forman neuronas eléctricamente activas y funcionalmente conectadas. Brustle et al. (Science 285: 754, 1.999) indican que las células precursoras derivadas de células madres embrionarias interactúan con neuronas huésped y mielinizan con eficacia los axones en el cerebro y la médula espinal.

Se ha generado un considerable interés por el desarrollo de células madre embrionarias, que se piensa que tienen el potencial para diferenciarse que muchos tipos de células. Se realizó un trabajo inicial sobre células madre embrionarias en ratones. Las células madre de ratón pueden ser aisladas de tanto células embrionarias tempranas como tejido germinal. Las características deseables de las células madre pluripotentes son que sean capaces de proliferación in vitro en un estado no diferenciado, que retengan un cariotipo normal y que retengan el potencial para diferenciarse a derivados de las tres capas germinales embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo).

El desarrollo de preparaciones de células madre pluripotentes humanas está considerablemente menos avanzado que el trabajo con células de ratón. Thomson et al., propagaron células madre pluripotentes de primates inferiores (Patente de EE UU. 5.843.78; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 7.844, 1.995) y después de seres humanos (Science 282: 114, 1.998). Gearhart y colaboradores derivaron estirpes celulares germinales embrionarias humanas (hEG, por sus siglas en inglés) de tejido gonadal fetal (Shamblott et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 13.726,1.998 y Patente de EE.UU. 6.9.622).

Tanto las células hES como las hEG presentan las características buscadas desde hace mucho tiempo de las células madres pluripotentes: se pueden cultivar in vitro sin diferenciación, presentan un cariotipo normal y se mantienen capaces de producir una serie de tipos diferentes de células. Las estirpes de células madre embrionarias humanas clonalmente derivadas mantienen pluripotencia y potencial proliferativo durante periodos prolongados en cultivo (Amit et al., Dev. Biol. 227: 271, 2.). Estas células implican una considerable promesa para uso en tratamiento humano, actuando como depósito para regeneración de casi cualquier tejido comprometido por anomalía genética, traumatismo o una enfermedad.

La Publicación de Patente Internacional WO 99/2741 (Geron Corp.) se refiere a métodos y a materiales para cultivar células madre primordiales derivadas de primate. En una realización, se proporciona un medio de cultivo celular para cultivar células madre primordiales derivadas de primate en un estado sustancialmente no diferenciado, con una presión osmótica baja y niveles bajos de endotoxina. El medio básico se combina con un suero de nutriente eficaz para soportar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primate y un sustrato de células alimentadoras o un componente de matriz extracelular derivado de células alimentadoras. El medio puede incluir

además aminoácidos no esenciales, un antioxidante y factores de crecimiento que son nucleósidos o una sal de piruvato.

Un reto significativo para el uso de células madre para tratamiento es controlar el crecimiento y la diferenciación en el tipo particular de tejido requerido para tratamiento de cada paciente.

La Patente de EE.UU. 4.959.313 (M. Taketo, Jackson Labs) proporciona una secuencia potenciadora particular que produce la expresión de un gen exógeno o recombinante de franqueo a partir de un activador que acompaña al gen que no produce normalmente expresión en células no diferenciadas. La Patente de EE.UU. 5.639.618 (D. A. Gay, Pluñon Inc.) propone un método para: aislar una célula madre específica del linaje in vitro, en el que se transinfecta una célula madre embrionaria pluripotente con una construcción en que un elemento genético específico del linaje se une de manera operable a un gen indicador, cultivar la célula en condiciones en que la célula se diferencie y después de separación de las células que expresan el indicador se separen de otras células.

La Patente de EE.UU. 6.87.168 (Levesque et. al., Cedars Sinai Med. Ctr.) se refiere a transdlferenciar células epidérmicas en neuronas viables útiles para tanto tratamiento de células como tratamiento de genes. Las células de la piel se transinfectan con un factor de transcripción neurogénico y se cultivan en un medio que contiene un oligonucleótido antisentido que corresponde a un regulador negativo de diferenciación neuronal.

La Publicación de Patente Internacional WO 97/3225 (Mclvor et al., U. Minnesota) propone un método para Injertar células madre hematopoyéticas resistentes a fármacos. Las células en el injerto son aumentadas por un gen de resistencia a fármacos (tal como dihidrofolato reductasa resistente a metotrexato), bajo el control de un activador funcional en células madre. Las células son administradas a un mamífero, que después se trata con el fármaco para incrementar el injerto de células transgénicas en relación a las células no transgénicas.

La Publicación de Patente Internacional WO 98/39427 (Stein et al., U. Massachusetts) se refiere a métodos para expresar genes exógenos en células diferenciadas tal como tejido esquelético. Las células madre (por ejemplo, de médula ósea) se ponen en contacto con un ácido nucleico en el que el gen se une a un elemento que controla la expresión en células diferenciadas. Es ejemplar el activador de osteocalcina de rata. La Publicación de Patente Internacional WO 99/1535 (Liu et al., Yale U.) propone un procedimiento para estudiar los cambios en la expresión de los genes en células madre. Se prepara un perfil de expresión de genes de una población de células madre y después se compara a un perfil de expresión de genes de células diferenciadas.

La Publicación de Patente Internacional WO 99/19469 (Braetscher et al., Biotransplant) se refiere a un método para cultivar células madres embrionarias pluripotentes del cerdo. Se inserta un gen marcador seleccionable en las células de manera que se regule mediante un control o secuencia activadora en las células ES, ejemplificado por el activador OCT-4 porcino.

La Publicación de Patente Internacional WO /15764 (Smith et al., U. Edinburgh) se refiere a propagación y derivación de células madres embrionarias. Las células se cultivan en presencia de un compuesto que inhibe de manera selectiva la propagación o la supervivencia de células... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende la estructura P-X, en la que:

X es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un producto que es letal para una célula en la que se expresa o hace una célula en la que se expresa susceptible de un efecto letal de un agente externo y P es un elemento de control transcripcional que produce que X se exprese preferiblemente en células madre pluripotentes de primate (pPS) no diferenciadas.

2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que X codifica una toxina o una proteína que induce o media muerte celular programada.

3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que X codifica una enzima que convierte un profármaco en un compuesto que es letal para una célula en la que se expresa X.

4. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en la que X codifica una timidina cinasa.

5. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que P-X es una molécula heteróloga introducida.

6. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que P es un elemento de control transcripcional endógeno.

7. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que P es un activador de OCT-4 o un activador de telomerasa transcriptasa inversa (TERT).

8. La molécula de ácido nucleico según cualquier reivindicación precedente, en la que la célula o las células madre son células madre embrionarias humanas (hES).

9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que el agente externo es ganciclovir.