Cebadores de polinucleótidos para detectar mutaciones de PIK3CA.

Un método de PCR para detectar la presencia o la ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de:

a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con una secuencia de polinucleótido cebador que consiste en la SEQ ID NO. 21, donde el polinucleótido se usa como cebador y el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia de PIK3CA por debajo de la región a la cual el polinucleótido es complementario, y llevar a cabo una PCR con la mezcla; y

b) detectar la hibridación del polinucleótido a la muestra de ácido nucleico en donde la hibridación indica la presencia de una mutación.

Cebadores de polinucleótidos para detectar mutaciones de PIK3CA Campo técnico

La presente invención se refiere a un polinucleótido, a un kit que comprende un polinucleótido y a un método para detectar la presencia o la ausencia de mutaciones en un gen.

Antecedentes de la técnica

Las fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) son una familia grande de quinasas lipídicas implicadas en la señalización celular. La ruta PI3K-AKT se activa en una señe de tipos de tumores, dando como resultado anormalidades en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia de las células (añadir referencia de 1 revisión reciente). Recientemente, se han identificado mutaciones de la subunidad catalítica de la clase 1A de PI3K (PIK3CA) en cánceres humanos111. La función concreta de dichas mutaciones en la carcinogénesis aún no ha sido definida con claridad, pero con un desarrollo continuo de una serie de inhibidores de PI3K dirigidos, la detección de mutaciones se hará cada vez más importante para la selección de pacientes. Los retos técnicos en la detección de dichas mutaciones se deben a las limitaciones de las biopsias tumorales, que pueden contener solamente cantidades pequeñas de las secuencias mutadas. Además, el ADN extraído de tejido embebido en parafina a menudo está degradado y es de baja calidad. El nivel mínimo de ADN muíante requerido para la detección por secuenciamiento es de 15-25% y por tanto existe una necesidad acuciante por desarrollar ensayos sensibles capaces de detectar cantidades pequeñas de alelos mutados en una muestra heterogénea y los productos necesarios para llevara cabo dichos ensayos.

La presente invención busca satisfacer esta necesidad.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona ensayos sensibles y robustos para mutaciones de PIK3CA portadas por tumores. En la presente memoria se describe:

Un método de PCR para detectar la presencia o la ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de:

a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con una secuencia de polinucleótido cebador que consiste en la SEQ ID NO. 21, donde el polinucleótido se usa como cebador y el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia de PIK3CA por debajo de la reglón a la cual el polinucleótido es complementarlo, y llevar a cabo una PCR con la mezcla; y

b) detectar la hibridación del polinucleótido con la muestra de ácido nucleico, donde la hibridación indica la presencia de una mutación.

Preferiblemente, el segundo cebador tiene una secuencia de acuerdo a la SEQ ID NO. 35.

La Invención también se refiere a un polinucleótido con una secuencia que consiste en la SEQ ID NO. 21.

Preferiblemente, el método comprende además la etapa de, previamente a la etapa a), amplificar el número de coplas del fragmento del gen PIK3CA empleando amplificación de ácido nucleico por ciclado térmico, preferiblemente PCR.

De forma ventajosa, la etapa b) comprende llevar a cabo una polimerización de ADN usando el polinucleótido como primer cebador y detectando el producto de extensión de la polimerización.

De forma conveniente, la etapa b) comprende la etapa de mezclar la muestra de ácido nucleico y el polinucleótido con un segundo cebador que se corresponde con una reglón del fragmento de la secuencia de PIK3CA por debajo de la reglón respecto a la cual el polinucleótido es complementario, y llevar a cabo una PCR de la mezcla.

Preferiblemente, el segundo cebador es la SEQ ID NO. 35.

Alternativamente, el método comprende además la etapa de llevar a cabo una PCR de la muestra usando cebadores de control y comparando la amplificación del gen PIK3CA con la amplificación usando el polinucleótido y el segundo cebador.

De forma ventajosa, los cebadores de control comprenden las SEQ ID NO. 37 y 39.

De forma conveniente, el polinucleótido comprende un grupo apagador y un grupo fluoróforo y en el que la etapa b) comprende exponer la mezcla a la luz de una longitud de onda a la cual responde el fluoróforo en ausencia del

grupo apagador, y detectar luz en la longitud de onda emitida por el grupo fluoróforo en ausencia del grupo apagador.

Se prefiere que el gen PIK3CA se la secuencia disponible en el GenBank con el n° de acceso NM_006218 versión n° NM_006218.2 Gl:54792081.

En esta especificación, "ARMS" es el sistema de mutación refractarlo de amplificación descrito, por ejemplo, en el documento EP-A-0332435.

Cuando se hace referencia en dicha especificación a un porcentaje de un polinucleótido comparado con un polinucleótido de referencia, éste puede determinarse mediante algoritmos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando el algoritmo BLASTP versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Scháffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) usando los parámetros por defecto.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra los resultados obtenidos al llevar a cabo detección y secuenciamiento Scorpions en muestras que contienen el gen PIK3CA muíante.

Descripción detallada

Las realizaciones de la presente invención proporcionan polinucleótidos cebadores que pueden usarse en ensayos para la detección de mutaciones del gen PIK3CA en una muestra que contenga ácidos nucleicos.

En realizaciones específicas, los polinucleótidos cebadores son cebadores directos e inversos que se hibridan con el gen PIK3CA para facilitar que se produzca una reacción de amplificación de PCR. Así, el cebador directo se híbrida en por encima (en dirección 3') y en la cadena opuesta al cebador inverso, y los cebadores directo e inverso definen conjuntamente una secuencia de ampliación que es amplificada durante la PCR. La secuencia del cebador directo se selecciona de tal modo que no sea complementaria a la secuencia natural, pero que sea capaz de hibridarse con una secuencia de PIK3CA muíante.

A fin de detectar la presencia del gen PIK3CA muíante en la muestra, los cebadores se mezclan con la muestra. Entonces se añaden los agentes necesarios para la PCR (los trifosfatos de nucleótido apropiados, la enzima de ADN polimerasa y la disolución tamponante) a la muestra y se lleva a cabo la PCR. Si la muestra contiene la secuencia muíante a la que el cebador directo es capaz de hibridarse, entonces el amplicón se amplifica durante PCR y la presencia de la secuencia muíante en la muestra es indicad de esa forma. Si la muestra no contiene la secuencia mutante entonces el cebador directo se une a la secuencia PIK3CA con baja eficacia y de esa forma hay poca o ninguna amplificación de la secuencia amplicón.

A fin de detectar la mutación H1047R, la secuencia de cebador directo es la SEQ ID NO 21. Sin embargo, debe apreciarse que la secuencia precisa del cebador directo no tiene porqué ser idéntica a dicha secuencia, siempre que el cebador directo se hibride con la secuencia mutante más fácilmente que con la secuencia natural. En las secuencias establecidas antes, son los últimos seis nucleótidos de los cebadores (es decir, los nucleótidos del extremo 3') los que proporcionan la especificidad de unión, por lo que dichos nucleótidos deben ser idénticos a la secuencia dada.

Para detectar la presencia de los amplicones formados en la muestra, el cebador inverso es un cebador denominado "Scorpions" en las realizaciones de la presente invención. Los detalles de los cebadores Scorpions se incluyen en el documento WO-A-99/066071. Un cebador "Scorpions" comprende una secuencia de cebador complementaria a una primera secuencia diana de un gen (en esta invención el PIK3CA) y una secuencia de cola comprende una secuencia sonda flanqueada por dos secuencias mutuamente complementarias. Se proporciona un resto bloqueante de ADN polimerasa (tal como un monómero de hexetilen glicol (HEG)) entre la secuencia de cebador y la secuencia de cola. Se proporciona un grupo fluoróforo en un extremo de la secuencia de cola y se proporciona un grupo apagador en el otro extremo de la secuencia de cola. Durante el uso, la secuencia de cebador del cebador Scorpions actúa como un cebador inverso durante la PCR de la manera normal y por tanto el cebador Scorpions completo, que incluye la secuencia de cola, acaba incorporada en todos los amplicones. El resto bloqueante de ADN polimerasa evita la duplicación de la secuencia de cola. De este modo, las secuencias mutuamente complementarias de la secuencia de cola tienen tendencia a hibridarse una... [Seguir leyendo]

1. Un método de PCR para detectar la presencia o la ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de:

a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con una 5 secuencia de pollnucleótido cebador que consiste en la SEQ ID NO. 21, donde el polinucleótldo se usa como

cebador y el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia de PIK3CA por debajo de la reglón a la cual el pollnucleótido es complementario, y llevar a cabo una PCR con la mezcla; y

b) detectar la hibridación del pollnucleótido a la muestra de ácido nucleico en donde la hibridación Indica la presencia de una mutación.

2. Un método según la reivindicación 1, donde el segundo cebador tiene una secuencia según la SEQ ID NO. 35.

3. Un polinucleótido con una secuencia que consiste en la SEQ ID NO. 21.