C1 ß-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares a partir de biomasa celulósica.

Polinucleótido que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante,

en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5), ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o

b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP), glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU), en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

C1 ß-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares a partir de biomasa celulósica Descripción La invención se refiere a la expresión de una ß-glucosidasa recombinante y su uso en la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica.

ANTECEDENTES

La biomasa celulósica es un recurso renovable significativo para la generación de azúcares. La fermentación de estos azúcares puede producir productos finales comercialmente valiosos, incluidos biocombustibles y productos químicos actualmente derivados del petróleo. Aunque la fermentación de azúcares simples a etanol es relativamente sencilla, la conversión eficaz de biomasa celulósica en azúcares fermentables tales como la glucosa, es un reto. Véase, por ejemplo, Ladisch et al., 1983, Enzyme Microb. Technol. 5:82. El material celulósico puede pretratarse químicamente, mecánicamente o de otras formas para aumentar la susceptibilidad de la celulosa a la hidrólisis. Tal pretratamiento puede ir seguido de la conversión enzimática de la celulosa en glucosa, celobiosa, celo-oligosacáridos y similares, utilizando enzimas que están especializadas en romper los enlaces ß-1-4 glicosídicos de la celulosa. Estas enzimas son conocidas colectivamente como "celulasas".

Las celulasas se dividen en tres subcategorías de enzimas: 1, 4-ß-D-glucano glucanohidrolasa ("endoglucanasa" o "EG") ; 1, 4-ß-D-glucano celobiohidrolasa ("exoglucanasa", "celobiohidrolasa" o "CBH") y ß-D-glucósido glucohidrolasa ("ß-glucosidasa", "celobiasa" o "BG") . Las endoglucanasas atacan al azar las partes interiores y fundamentalmente las regiones amorías de la celulosa, produciendo principalmente glucosa, celobiosa y celotriosa. Las exoglucanasas acortan progresivamente las moléculas de glucano uniéndose a los extremos del glucano y liberando principalmente unidades de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. Las ß-glucosidasas dividen la celobiosa, un dímero de glucosa unido en ß-1, 4 soluble en agua, en dos unidades de glucosa. La producción eficaz de celulasas para su uso en el procesamiento de biomasa celulósica reduciría los costos y aumentaría la eficacia de producción de biocombustibles y otros compuestos con valor comercial. En el documento WO2008/008070 y en Gusakov et al., 2007 (Carbohydrate research, 343:48-55) se describe una ß-glucosidasa de Chr y sosporium lucknowense.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

La invención también proporciona vectores de expresión que comprenden el polinucleótido de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo.

La invención también proporciona un método de producción de un polipéptido ß-glucosidasa secretado, que comprende cultivar una célula que comprende un polinucleótido de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo, o un vector de expresión de la invención, en condiciones en las que se produce ß-glucosidasa.

La invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, en el que la secuencia codificante no comprende intrones.

La invención también proporciona una composición que comprende una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381

(381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, y una proteína ß-glucosidasa secretada por la célula.

La invención también proporciona un método de producción de glucosa a partir de celobiosa, que comprende poner en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, en condiciones en las que la ß-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha ß-glucosidasa.

En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de un polipéptido ß-glucosidasa secretado, mediante el cultivo de una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 ß-glucosidasa (SEQ ID NO: 3) o una variante enzimáticamente activa de la misma según la invención, unida operativamente a un promotor heterólogo, en condiciones en las cuales se produce ß-glucosidasa. La célula puede ser una célula de la cepa C1. Como alternativa, la célula puede ser distinta de una célula de la cepa C1. En algunos casos, el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a) . En algunos casos, la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. Opcionalmente, la secuencia polinucleotídica codifica la SEQ ID NO: 4.

En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de glucosa a partir de celobiosa, poniendo en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica C1 ß-glucosidasa (SEQ ID NO: 3) o una variante enzimáticamente activa de la misma según la invención, unida operativamente a un promotor heterólogo, en condiciones en las que la ß-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha ß-glucosidasa. La célula puede ser una célula de la cepa C1. Como alternativa, la célula puede ser distinta de una célula de la cepa C1. En algunos casos, el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a) . En algunos casos, la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. Opcionalmente, el polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 4.

También se contempla un método de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, combinando la ß-glucosidasa recombinante generada según la invención, con el sustrato de biomasa (por ejemplo, celobiosa) en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. En algunos casos, el método incluye la etapa de recuperar la ß-glucosidasa a partir del medio en el que se cultiva la célula. En un aspecto, se proporciona una composición que comprende la ß-glucosidasa recombinante.

En un aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1 en el que el polipéptido ß-glucosidasa recombinante comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

3. Polinucleótido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 9.

4. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, unido operativamente a un promotor heterólogo.

5. Método de producción de un polipéptido ß-glucosidasa secretado, que comprende cultivar una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, unido operativamente a un promotor heterólogo, o un vector de expresión según la reivindicación 4, en condiciones en las que se produce ß-glucosidasa.

6. Célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, en el que la secuencia codificante no comprende intrones, y en el que opcionalmente el polinucleótido está unido operativamente a un promotor heterólogo, y en el que opcionalmente la célula expresa al menos otra enzima celulasa recombinante.

7. Composición que comprende una célula que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante unido operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, y una proteína ß-glucosidasa secretada por la célula.

8. Método de producción de glucosa a partir de celobiosa, que comprende poner en contacto celobiosa con una célula recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido ß-glucosidasa recombinante, unida operativamente a un promotor heterólogo, en el que dicho polipéptido:

a) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende una secuencia amino terminal que se expone como IESRK (SEQ ID NO: 5) , ESRK (SEQ ID NO: 29) o SRK; y/o es una proteína secretada derivada de una preproteína, en el que la preproteína es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia amino terminal que comprende la SEQ ID NO: 6 o NO: 7; y/o b) es al menos un 90% idéntico a la SEQ ID NO: 3 y comprende al menos uno, al menos dos, o tres residuos de aminoácidos seleccionados de entre ácido aspártico en la posición 358 (358ASP) , glutamina en la posición 381 (381 GLN) y ácido glutámico en la posición 385 (385GLU) , en los que los números de posición de los aminoácidos corresponden a la SEQ ID NO: 4, en condiciones en las que la ß-glucosidasa es expresada y secretada por la célula y dicha celobiosa es convertida enzimáticamente en glucosa por dicha ß-glucosidasa.

9. Método según la reivindicación 5 u 8 en el que la célula es una célula de la cepa C1.

10. Método según la reivindicación 5 u 8 en el que la célula no es una célula de la cepa C1.

11. Vector de expresión según la reivindicación 4, método según la reivindicación 5 u 8, célula hospedadora recombinante según la reivindicación 6, o composición según la reivindicación 7, en los que el promotor heterólogo es el promotor de C1 celobiohidrolasa 1a (CBH1a) .

15 12. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, vector de expresión según la reivindicación 4 u 11, o método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8, 9, 10 y 11 en los que la secuencia polinucleotídica no codifica una o más de entre la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8, 9, 10 y 11, que comprende adicionalmente recuperar la ß-glucosidasa a partir del medio en el que se cultiva la célula. 14. Método de conversión de un sustrato de biomasa en un azúcar fermentable, que comprende combinar la célula según la reivindicación 6 con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. 15. Método según la reivindicación 14 en el que el sustrato de biomasa es la celobiosa y el azúcar fermentable es la glucosa.