Biomarcadores combinatorios para aplicaciones clínicas en la gestión del paciente con cáncer de pulmón.

Un método para la detección, diagnóstico o determinación del estadío del cáncer de pulmón en un paciente,

comprendiendo el método el análisis combinado de las proteínas CYFRA 21-1 y LRG-1, en una muestra de sangre del sujeto, proporcionando dicho análisis combinado una indicación de la presencia, estadío o progresión del cáncer de pulmón en el paciente.

Biomarcadores combinatorios para aplicaciones clínicas en la gestión del paciente con cáncer de pulmón La presente invención se refiere a la evaluación del cáncer de pulmón en una muestra de sangre usando una combinación de biomarcadores, denominados CYFRA 21-1 y glucoproteína alfa-2 rica en leucina (LRG-1) . La medida de la combinación puede usarse para la detección temprana o para el seguimiento de pacientes que tienen cáncer de pulmón, incluyendo cáncer NSCLC, con una elevada sensibilidad y selectividad.

Antecedentes El cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer y cada día se diagnostican en todo el mundo 1, 4 millones de nuevos casos. Más de dos tercios de los cánceres de pulmón se diagnostican en un estadío tardío, cuando aparecen los síntomas clínicos. La tasa de supervivencia general después del diagnóstico varía desde el 14 % en EE.UU. hasta el 1, 1 % en algunas regiones de Asia (Stewart y Kleihues, 2003) y actualmente es muy baja debido al diagnóstico tardío de la enfermedad. Los métodos diagnósticos actuales se basan en técnicas de obtención de imágenes y procedimientos invasivos, tales como broncoscopia o biopsia (Rivera et al., 2003) . Los pocos biomarcadores plasmáticos conocidos para el cáncer de pulmón, tales como el antígeno carcinoembriónico (CEA) , antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC) y enolasa específica de neuronas (NSE) carecen de la suficiente sensibilidad y especificidad (Kulpa et al., 2002) como para usarse como herramientas de diagnóstico temprano. Los esfuerzos actuales que usan tecnologías de descubrimiento de alto rendimiento siguen luchando para proporcionar biomarcadores de cáncer de pulmón fiables y fácilmente accesibles para su uso clínico (Zolg, 2006; Beane et al., 2009) . Stieber et al., 2006 es una revisión del estado actual del conocimiento del uso clínico de marcadores basados en suero.

El análisis global del proteoma se ha visto obstaculizado por una diversidad de problemas metodológicos incluyendo el hecho de que las tecnologías de perfil proteómico basadas en espectrometría de masas están en general lejos de abarcar el rango dinámico necesario; no son adecuadamente sensibles y carecen de la suficiente reproducibilidad y rendimiento (Rifai et al., 2006) . Los anticuerpos policlonales y monoclonales (mAb) proporcionan herramientas adecuadamente validadas para la caracterización y el análisis cuantitativo de las proteínas, pero se han dirigido principalmente a una serie de epítopos con baja complejidad (Gao, 2005; Knezevic, 2001) . Las estrategias globales de proteómica de anticuerpos pretenden generar bibliotecas de anticuerpos para abarcar la mayoría o todas las proteínas individuales y sus epítopos inmunogénicos en cualquier proteoma complejo. La presentación en fago recombinante, bacteriana y viral representan estrategias para la generación global de anticuerpos pero han tenido un éxito limitado para dar como resultado bibliotecas capaces de detectar proteomas complejos con reactivos y cobertura de afinidad de suficiente calidad (Maneewatch, 2009; Houimel y Dellagi, 2009) . The Human Protein Atlas (Uhlen, 2005) y otras grandes iniciativas, tales como NCI Clinical Proteomics Technology Initiative (Blow, 2007) se dirigen a la generación de bibliotecas exhaustivas para el mucho más complejo proteoma humano, usando ambas estrategias proteínas recombinantes como inmunógenos. El problema con las proteínas recombinantes es que no representan el estado natural de la proteína, carecen de modificaciones postraduccionales y de un plegado correcto, limitando de este modo el potencial de las bibliotecas obtenidas para elaborar perfiles de proteomas naturales.

Sumario La presente divulgación se refiere a la evaluación o control del cáncer de pulmón ("LC") usando una combinación de biomarcadores de proteínas. Ésta divulga el uso de una proteína CYFRA en combinación bien con una de las siguientes proteínas o sus combinaciones: haptoglobina (HPT) , alfa-1-antiquimotripsina (ACT) , alfa-2 glucoproteína 1 rica en leucina (LRG-1) , y factor de complemento 9 (C9) , para detectar o controlar el cáncer de pulmón en sujetos humanos. Sorprendentemente, la solicitud demuestra que la medida de una cualquiera de estas combinaciones permite la detección temprana o el seguimiento de los pacientes que tienen cáncer de pulmón, incluyendo cáncer NSCLC, con una sensibilidad y selectividad destacablemente elevada.

El objeto de esta invención se refiere a métodos y usos tal como se definen en las reivindicaciones. Más en particular, la invención se refiere a un método para la detección, diagnóstico o determinación del estadío del cáncer de pulmón en un paciente, comprendiendo el método el análisis combinado de las proteínas CYFRA 21-1 y LRG-1, en una muestra de sangre del sujeto, proporcionando dicho análisis combinado una indicación de la presencia, estadío o progresión del cáncer de pulmón en el paciente.

La invención es particularmente adecuada para detectar o controlar el cáncer de pulmón en sujetos humanos, particularmente cáncer en estadío I y II, por ejemplo, en estadío Ia y IIa.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de CYFRA 21-1 en combinación con LRG-1 para el diagnóstico y/o gestión del LC. Otro objeto de la invención se refiere al uso de CYFRA 21-1 en combinación con al menos LRG-1 para el diagnóstico y/o gestión del LC.

También se divulga un método para la detección, diagnóstico, determinación del estadío o gestión de LC en un paciente, comprendiendo el método el análisis combinado de (i) una proteína CYFRA, y (ii) al menos una segunda proteína seleccionada entre ACT, HPT y C9, en una muestra del sujeto, proporcionando dicho análisis combinado una indicación de la presencia, estadío o progresión del cáncer de pulmón en el paciente.

La expresión "análisis combinado" indica que los marcadores indicados se ensayan (por ejemplo, respecto de su presencia, cantidad, nivel de expresión relativa, variaciones, etc.) en la muestra, bien de manera simultánea o por separado. Esta es la medida combinada o variación de los al menos dos marcadores que proporciona una indicación relevante y específica de la enfermedad.

En una realización particular, el método comprende proporcionar una muestra de sangre del sujeto, poner en contacto dicha muestra, o una alícuota de la misma, con un primer reactivo de unión específico que se une a una proteína CYFRA 21-1 y con al menos un segundo reactivo específico que se une a una proteína LRG-1, y determinar la presencia o cantidad de proteína unida a dichos reactivos de unión. La puesta en contacto con los al menos 2 reactivos de unión puede llevarse a cabo de manera simultánea o secuencial, en (una misma alícuota de) la muestra o en diferentes alícuotas de la misma muestra. Los reactivos de unión son, lo más preferentemente, anticuerpos o fragmentos de los mismos que mantengan especificidad por el antígeno.

En otra realización particular, el anticuerpo anti-LRG-1 o un fragmento del mismo es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a LRG-1 humana y que se une a un péptido que tiene una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº: 26-35 y 57-63.

En otra realización particular, el anticuerpo anti-CYFRA 21-1 o un fragmento del mismo es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al fragmento de citoqueratina 19, CYFRA 21-1, o a una proteína o péptido que comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº: 93-96.

Leyenda de las figuras Figura 1. Diagrama de puntos que muestra CYFRA 21-1, ACT, LRG-1, C9 y Hpt medidas mediante ELISA en muestras de plasma de controles sanos (n = 158) y pacientes de cáncer de pulmón (n = 230) .

Las estadísticas se muestran como diagramas de cajas para cada grupo, donde la parte inferior y superior de la caja representan los percentiles 25º y 75º; la banda en la caja es el valor de la mediana.

Figura 2. Curvas patrón de ensayos de ELISA sándwich con (a) anticuerpos anti-ACT; (b) anticuerpos anti-beta-HPT; (c) anticuerpos anti-CFH; (d) anticuerpos anti-LRG; (e) anticuerpos anti-C9.

Figura 3. Análisis de curvas de operador de receptor (ROC) del rendimiento diagnóstico de biomarcadores individuales y combinaciones de biomarcadores.

(a) todos los estadíos de LC: azul - LRG, ABC = 0, 85; negro - CYFRA, ABC = 0, 91; rojo - CYFRA + LRG, ABC = 0, 93; verde - CYFRA + LRG + ACT + C9 + Hpt + CFH, ABC = 0, 94;

(b) solo estadío I de LC: azul - LRG, ABC = 0, 88; negro - CYFRA, ABC = 0, 92; rojo -CYFRA + LRG, ABC = 0, 95; verde -CYFRA + LRG + ACT + C9 + Hpt + CFH, ABC = 0, 96;

(c) estadíos II, III y IV de LC: azul - LRG, ABC = 0, 92; negro - CYFRA, ABC = 0, 91; rojo - CYFRA... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección, diagnóstico o determinación del estadío del cáncer de pulmón en un paciente, comprendiendo el método el análisis combinado de las proteínas CYFR.

2. 1 y LRG-1, en una muestra de sangre del sujeto, proporcionando dicho análisis combinado una indicación de la presencia, estadío o progresión del cáncer de pulmón en el paciente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que analizar dichas proteínas comprende poner en contacto la muestra, o una alícuota de la misma, con un primer reactivo de unión específico que se une a una proteína CYFR.

2. 1 y con al menos un segundo reactivo específico que se une a una proteína LRG-1, y determinar la presencia o cantidad de proteína unida a dichos reactivos de unión.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha puesta en contacto con los al menos 2 reactivos de unión se lleva a cabo de manera simultánea o secuencial, en la misma muestra o en diferentes alícuotas de una misma muestra.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, en el que los reactivos de unión son anticuerpos o fragmentos de los mismos que retengan especificidad de antígeno.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón en estadío I o II.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón en estadío Ia o IIa.

7. El método de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo anti-LRG-1 o un fragmento del mismo es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a LRG-1 humana y que se une a un péptido que tiene una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº.

2. 35 .

5. 63.

8. El método de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo anti-CYFR.

2. 1 o un fragmento del mismo es un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a un fragmento de citoqueratina 19 humana, CYFRA21-1, o a una proteína o péptido que comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº.

9. 96.

9. El uso de CYFR.

2. 1 en combinación con LRG-1 como biomarcadores proteínicos para la detección, diagnóstico determinación del estadío del cáncer de pulmón en una muestra de sangre de los sujetos.

10. El uso de la reivindicación 9, para la detección de LC en estadío I, particularmente estadío Ia.

11. El uso de la reivindicación 9, para la detección de LC en estadío II, particularmente estadío IIa.