Aumento de la hidrólisis de fibras por adición de proteasa.

Un método para aumentar la cantidad de glucosa y otros azúcares y péptidos liberados de una materia prima de fibra que comprende:

(a) hacer reaccionar una materia prima de fibra con una mezcla de reactivos que contenga al menos una proteasa y al menos un elemento del grupo que consiste en celulasa y hemicelulasa, donde la proteasa se elige del grupo que consiste en proteasas aspárticas de mohos que son miembros de los géneros de los hongos Ascomicetes representados por el género Aspergillus y tiene una secuencia de aminoácidos al menos más de 70% idéntica a SEQ ID NO: 1 y se retiene una actividad de proteasa y es adicional a cualquier proteasa endógena con la celulasa o hemicelulasa; y

(b) obtener un producto de reacción de dicha materia prima de fibra y dicha mezcla de reactivos que contiene glucosa, donde la cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra en las mismas condiciones que la reacción del paso (a), pero con al menos un elemento elegido del grupo que consiste en celulasa y hemicelulasa y excluida la proteasa.

Aumento de la hidrólisis de fibras por adición de proteasa

1. Campo de la invención

[1] Las enseñanzas de la presente se refieren, pero no exclusivamente, al campo de la producción de productos agrícolas. Las realizaciones se refieren, por ejemplo, a métodos para aumentar la glucosa libre y otras materias orgánicas disponibles a partir de una materia prima de fibra para fermentación y otras aplicaciones.

2. Antecedentes de la técnica relacionada

[2] Se dispone de una gran cantidad y variedad de materias primas de fibra para las operaciones de procesamiento agrícolas. Estas materias primas de fibra (también denominadas materias primas celulósicas, biomasa o lignocelulósicas) se pueden utilizar, por ejemplo, para producir combustible, para producir productos químicos industriales, o como otros alimentos y piensos con valor agregado. La materia prima celulósica se compone en gran parte de paredes de células vegetales con celulosa, hemicelulosa, lignina y polímeros de proteínas como los constituyentes primarios. La hidrólisis o la descomposición de estas materias primas utiliza individualmente o una combinación de métodos enzimáticos y termoquímicos que resultan en la producción de monómeros y oligómeros de carbohidratos. La mezcla hidrolizada puede servir como materia prima para producir combustible, productos químicos y otros productos. Se emplean esquemas de hidrólisis similares con la mayoría de las fibras vegetales que facilitan la liberación de glucosa y otros carbohidratos de las materias primas de fibra.

[3] Aunque se ha prestado atención al aumento de la cantidad de glucosa disponible de composiciones como el almidón granular crudo (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos N° 26/154354 A1, para Duan, et al.), últimamente se ha prestado más atención a los métodos para aumentar la cantidad de carbohidratos utilizables obtenidos de materias primas de fibra fácilmente accesibles y económicas que no contienen almidón o contienen cantidades mínimas.

[4] XP 2673412 (Resumen Ejecutivo / CRADA; 1999) da a conocer pasos de procesamiento que incluyen la producción de enzima celulasa, la sacarificación y fermentación simultáneas de carbohidratos hexosa, y una fermentación de pentosa por separado para convertir xilosa o arabinosa en etanol.

[5] WO 3/15889 A1 da a conocer un proceso para recuperar los componentes del grano del destilador, como porej., los componentes del grano seco de destilería (DDG), para utilizaren diversas aplicaciones, por ejemplo en la producción de etanol.

Breve resumen de la invención

[6] Las realizaciones de la invención apuntan en general a proporcionar un método para aumentar la cantidad de glucosa y otros carbohidratos obtenidos de la hidrólisis de una corriente de fibra con bajo contenido de almidón o sin almidón, mediante hidrólisis de la corriente de fibra en presencia de proteasa y una o más de celulasas y hemicelulasas.

[7] Las realizaciones incluyen un método para aumentar la cantidad de glucosa y otras materias orgánicas liberadas de una materia prima de fibra, que comprende hacer reaccionar una materia prima de fibra con una mezcla de reactivos que contenga al menos una proteasa y al menos un elemento del grupo formado por celulasa y hemicelulasa; donde la proteasa se elige del grupo que consiste en proteasas aspárticas de mohos que son miembros de los géneros de los hongos Ascomicetes, representados por el género Aspergillus y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos más de 7% idéntica a SEQ ID NO: 1 y se retiene una actividad de proteasa y es adicional a cualquier proteasa endógena con la celulasa o hemicelulasa; y obtener un producto de reacción de la materia prima de fibra y la mezcla de reactivos que contiene glucosa. La cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra en las mismas condiciones que la reacción que incluye proteasa, pero con al menos un elemento elegido del grupo que consiste en celulasa y hemicelulasa y excluida la proteasa. En algunas realizaciones, la mezcla de reactivos utilizada para aumentar la cantidad de glucosa y otras materias orgánicas liberadas de la corriente de fibra no incluye amilasas.

[8] Las proteasas son enzimas que han encontrado un gran número de aplicaciones en la producción industrial de detergentes, el procesamiento de pieles animales, el ablandamiento de la carne, así como en otras aplicaciones alimentarias que involucran materiales animales y vegetales. Como grupo representan una de las más grandes clases de enzimas hidrolíticas que posee una amplia gama de especificidades frente a las secuencias de aminoácidos, diferente pH y temperatura óptima, y diferentes aminoácidos en los sitios activos, algunas de las cuales (por ejemplo, metaloproteasas) requieren cationes como cinc o hierro para una actividad óptima. Aunque

diversas proteasas pueden ser adecuadas para usar en las realizaciones de la invención, según se define en la reivindicación 1, habitualmente se prefiere una proteasa fúngica ácida. En una realización, la proteasa fúngica ácida tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización, la proteasa se elige del grupo que consiste en proteasa aspártica de Aspergillus saitoi, o proteasas aspárticas de mohos que son miembros de los géneros de los hongos Ascomicetes representados por el género Aspergillus. En una realización típica, la proteasa es proteasa aspártica de Aspergillus saitoi, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[9] Una gran variedad materias primas de fibra son adecuadas para utilizar en las realizaciones de la invención. Las materias primas de fibra incluyen, pero no exclusivamente, rastrojo de maíz, pienso de gluten de maíz (CGF), granos secos de destilería (DDG), granos secos de destilería con solubles (DDGS), pasto varilla, miscanthus, cascarilla de soja, paja de trigo desmenuzada y paja de trigo. En una realización típica, la materia prima de fibra contiene menos de 2% en peso de almidón, menos de 1% en peso de almidón, menos de 5% en peso de almidón, o menos de 1% en peso de almidón. En otra realización, la materia prima de fibra no contiene almidón.

[1] Varias celulasas son adecuadas para usar en las realizaciones típicas de la invención. Éstas incluyen, por ejemplo, pero no exclusivamente CELLUCLAST® (un producto de Novozyme), que es una 1,4-(1,3:1,4)-(3-D-glucan 4-glucano-hidrolasa producida por fermentación sumergida del hongo Trichoderma reesei, depositado como ATCC N° 26921; o GC-22 (un producto de Genencor). Otras celulasas útiles incluyen las de T. reesei, otras especies de Trichoderma, especies de Aspergillus, especies de Crysosporium, especies de clostridio o celulasas de otras especies bacterianas y fúngicas.

[11] Diversas hemicelulasas son adecuadas para usar en las realizaciones típicas de la invención, incluidas, por ejemplo, pero no exclusivamente, Ultraflo L (Novozyme), Multifect Xylanase (Genencor), Viscozyme L (Novozyme) y Viscostar L (Dyadic). Los productos de reacción también pueden incluir una o más de arabinosa, xilosa, galactosa, mañosa, celobiosa, xilobiosa, grupos acetilo, fitoesteroles, compuestos fenólicos y oligómeros de estos compuestos.

[12] La cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) después de la adición de la proteasa es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra sin proteasa, en al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8% , al menos 9%, o al menos 1%.

[13] Otra realización incluye un método para obtener un residuo sólido de la fibra tratada con enzima para la producción de bioaceite, que comprende preparar un producto de reacción de materia prima de fibra enriquecido con glucosa como se describe en otras realizaciones de la invención, y separar dicho producto de reacción en una fracción de fibra hidrolizada sólida y una fracción líquida. Esta fracción sólida se puede utilizar después como combustible para la producción de bioaceite. El proceso empleado en el tratamiento mencionado se denomina a menudo hidrotratamiento o HT. Se puede usar con corrientes de fibra que contengan un nivel bastante elevado de humedad generalmente superior a 5% en base peso/peso.

Descripción detallada de la invención

[14] La presente instrucción describe varias características y aspectos diferentes de la invención en relación con diversas realizaciones ejemplares.

1. Un método para aumentar la cantidad de glucosa y otros azúcares y péptldos liberados de una materia prima de fibra que comprende:

(a) hacer reaccionar una materia prima de fibra con una mezcla de reactivos que contenga al menos una proteasa y al menos un elemento del grupo que consiste en celulasa y hemicelulasa, donde la proteasa se elige del grupo que consiste en proteasas aspárticas de mohos que son miembros de los géneros de los hongos Ascomicetes representados por el género Aspergillus y tiene una secuencia de aminoácidos al menos más de 7% idéntica a SEQ ID NO: 1 y se retiene una actividad de proteasa y es adicional a cualquier proteasa endógena con la celulasa o hemicelulasa; y

(b) obtener un producto de reacción de dicha materia prima de fibra y dicha mezcla de reactivos que contiene glucosa, donde la cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra en las mismas condiciones que la reacción del paso (a), pero con al menos un elemento elegido del grupo que consiste en celulasa y hemicelulasa y excluida la proteasa.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha mezcla no incluye amilasa.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteasa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteasa se elige del grupo que consiste en proteasa aspártica de

Aspergillus saitoi.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicha proteasa es la proteasa aspártica de Aspergillus saitoi, dicha proteasa aspártica de Aspergillus saitoi tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha materia prima de fibra se elige del grupo que consiste en rastrojo de maíz, pienso de gluten de maíz (CGF), granos secos de destilería (DDG), granos secos de destilería con solubles (DDGS), pasto varilla, cascarilla de soja, paja de trigo desmenuzada y paja de trigo.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicha materia prima de fibra contiene menos de 2% en peso de almidón.

8. El método de la reivindicación 1, donde dicha mezcla de reactivos comprende celulasa, y donde dicha celulasa comprende una o más de endo-p-1,4 glucanasas, exocelobiohidrolasas, p-glucosidasa (celobiasa) y exoglucanasas.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha mezcla de reactivos comprende hemicelulasa, y dicha hemicelulasa comprende una o más de endo-1,4-p-xilanasa, p-xilosidasa, p-endomananasa, p-manosidasa, pectina Nasa, pectato Nasa, a-L-arabinofuranosidasa, a-glucuronidasas, a/p-galactosidasas y varias esterasas.

1. El método de la reivindicación 1, donde dicho producto de reacción comprende además arabinosa, xilosa, galactosa, mañosa, celulobiosa, maltosa y maltotriosa.

11. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra en al menos 1%.

12. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad de glucosa en el producto de reacción (medida como porcentaje de la masa de la materia prima de fibra) es mayor que la cantidad de glucosa obtenida de la reacción de la materia prima de fibra en al menos 2%.

13. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteasa tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

14. Un método para obtener una fibra hidrolizada sólida para la producción de bioaceite, que comprende:

(a) preparar un producto de reacción de acuerdo con la reivindicación 1; y

(b) separar dicho producto de reacción en una fracción de fibra hidrolizada sólida y una fracción líquida; y usar la fibra hidrolizada sólida en un proceso para la producción de bioaceite.