Aparato y método para dispensar células o partículas confinadas en una gota en vuelo libre.

Un aparato para dispensar una o más células o partículas (48) confinadas en una gota en vuelo libre (52),

que comprende:

un dispositivo de generación de gotas de activación piezoeléctrica (10) configurado para expulsar fuera de un orificio (14; 44) una gota en vuelo libre de una suspensión (46) de células o partículas (48), comprendiendo dicho dispositivo de generación de gotas (10) un canal unidireccional sin ramificar (12; 56) que tiene la abertura del orificio (14; 44) en un extremo del mismo;

un dispositivo (16, 18) de detección de información sobre células o partículas localizadas en un volumen de observación (50) de la suspensión (46) dentro del canal unidireccional sin ramificar (12; 56); y

medios (20; 110; 120; 130; 140) para dirigir una gota expulsada (52) a una primera posición o a una segunda posición en función de la información detectada,

caracterizado por que el dispositivo de generación de gotas de activación piezoeléctrica (10) es un dispositivo de generación de gotas a demanda de activación piezoeléctrica (10).

Aparato y método para dispensar células o partículas confinadas en una gota en vuelo libre.

La presente invención se refiere a un aparato y un método para dispensar células o partículas confinadas en una 5 gota en vuelo libre, y, en particular, a un aparato y un método apropiado para dispensar y/o imprimir un número definido de forma precisa de células o partículas confinadas en una gota en vuelo libre.

De acuerdo con el estado de la técnica, pueden detectarse células individuales, manipularse y, en particular, clasificarse por medio de la citometría de flujo (FCM) . La citometría de flujo se describe por H.M. Shapiro, "Microbial 10 analysis at the single-cell level: tasks and techniques", Revista de Métodos Microbiológicos, vol. 42, páginas 3-16, 2000. La citometría de flujo es una tecnología establecida, proporcionada por diversas empresas comerciales y aplicadas en muchas aplicaciones. En general, un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales, una célula de flujo que permite una corriente de líquido, un sistema de medición, un detector y un sistema de conversión analógico a digital (ADC) , un sistema de amplificación y un ordenador para el análisis de las señales. La célula de 15 flujo permite que la corriente de líquido pueda usar un fluido envolvente y llevar y alinear las células de manera que pasen en una sola fila, es decir, de una en una, a través de un haz de luz de detección. El sistema de medición usa comúnmente la medición de la impedancia o la conductividad o hace uso de sistemas ópticos. Los sistemas ópticos usados comúnmente pueden comprender lámparas (mercurio, xenón) , láseres refrigerados por agua de alta potencia (tal como el argón, kriptón o láseres de colorantes) , láseres refrigerados por aire de baja potencia (como el 20 láser de argón a una longitud de onda de 488 nm, láseres HeNe rojos en una longitud de onda de 633 nm, láseres de HeNe verdes o láseres de HeCd (UV) ) , láseres de diodo (azul, verde, rojo, violeta) para proporcionar señales de luz. El detector y el sistema de conversión analógico a digital generan una dispersión frontal (FSC) , una dispersión lateral (SSC) , así como señales de fluorescencia de luz y las convierte en señales eléctricas que pueden procesarse por un ordenador. El sistema de amplificación puede ser lineal o logarítmico. 25

La FCM permite la separación y la clasificación de las células únicas de acuerdo con las propiedades ópticas específicas de alto rendimiento. Sin embargo, la FCM no es capaz de ocuparse de un volumen de muestra muy pequeño (tal como, de 1 a 10 l) , debido a las condiciones de flujo estacionario que tienen que establecerse dentro del citómetro. Por la misma razón, la FCM no puede entregar un número definido de células vivas en una pequeña 30 alícuota de líquido con un volumen de 100 nl o por debajo. El mecanismo de clasificación de la FCM se basa en un flujo estacionario dentro de la célula de flujo que no pueden encenderse y apagarse en un tiempo suficientemente corto.

También hay esfuerzos en la técnica para miniaturizar la FCM en un tamaño más pequeño y más compacto. Se han 35 introducido los citómetros de flujo de laboratorio en un chip (LOAC) (DCA-FCM) cuyo objetivo es proporcionar una FCM de coste relativamente bajo, pequeña y compacta. Se hace referencia a K. Cheung, S. Gawad, y P.Renaud, "Impedance spectroscopy flow cytometr y : On-chip label-free cell differentiation", Citometría Parte A, vol. 65A, páginas124-132, 2005 y el documento US 7.294.249 B2. El documento US 7294249 B2 divulga un componente microfluídico y un método en un fluido usando un sustrato que tiene un canal para conducir a su través partículas 40 individuales para clasificar las partículas en un flujo de fluido, en particular en un flujo de un líquido. El componente comprende una zona de preparación de influir y separar específicamente las partículas por medio de dielectroforesis, una zona del canal de medición que tiene al menos dos zonas de detección dispuestas en serie con respecto a la dirección de flujo del fluido, y una zona de clasificación que tiene unos dispositivos de electrodo para clasificar las partículas identificadas en la zona del canal de medición. Por lo tanto, el documento US 7294249 B2 45 divulga un dispositivo miniaturizado para analizar, contar y clasificar células o partículas que no necesitan un etiquetado de las células. Sin embargo, las tecnologías FCM, ya sean las convencionales o en miniatura, no facilitan localizar las células o partículas seleccionadas para aplicaciones avanzadas como conjuntos de células únicas o la impresión de células y deben considerarse como métodos continuos.

Recientemente, la tecnología de impresión de inyección de tinta se ha explotado para entregar las células vivas en lugar de tintas para localizar las células precisamente en patrones deseados, véase T. Xu, J. Jin, C. Gregor y , JJ Hickman, y T. Boland, "Inkjet printing of viable mammalian cells", Biomateriales, vol. 26, páginas 93-99, 2005, y S. Moon, S.K. Hasan, Y.S. Song, F. Xu, H.O. Keles, F. Manzur, S. Mikkilineni, J.W. Hong, J. Nagatomi, E. Haeggstrom, A. Khademhosseini y U. Demirci, "Layer by Layer Three-dimensional Tissue Epitaxy by Cell-Laden Hydrogel 55 Droplets" Ingeniería de tejidos Parte C: Métodos, vol. 16, páginas 157-166, 2010. Además, se hace referencia al documento US 2009/0208577 A1. La tecnología de impresión de inyección de tinta permite volúmenes mucho más pequeños de alícuotas, y al mismo tiempo, la impresión resuelta espacial de las células confinadas en las gotas. Se han demostrado varias aplicaciones usando esta tecnología, especialmente en la construcción de tejidos u órganos artificiales, la disposición de células de detección de alto rendimiento de células en el descubrimiento de fármacos, el 60 estudio y el análisis básico de la célula. La tecnología de impresión de inyección de tinta confina a las células en un volumen de líquido que se inyecta en la forma de una gota en vuelo, de manera que ofrece una técnica de manipulación de células no invasiva o mínimamente invasiva. Aunque el concepto de células impresas suspendidas en gotas en vuelo libre se ha presentado anteriormente, el número de células por gota es en general aleatorio, véase U. Demirci y G. Montesano, "Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets", Laboratorio en un chip, vol. 7, páginas 1139-1145, 2007.

El documento US 2008/0286751 A1 divulga un dispositivo dispensador para gotas de microfluidos especialmente para citometría. Un micro-canal principal se extiende entre dos tanques primero y segundo y una suspensión celular 5 homogénea o heterogénea que pasa a través del micro-canal principal. Un segundo micro-canal atraviesa el micro-canal principal y comprende un orificio de inyección. Tras la generación de una onda de presión en el segundo canal, puede expulsarse una gota a través del orificio de eyección. Las mediciones de impedancia y/o los análisis ópticos se usan para medir las propiedades de las células que circulan en el micro-canal principal. Las células o partículas se identifican de acuerdo con las características pertinentes, se detectan eléctricamente y/u ópticamente, 10 en particular por criterios de tamaño, conductividad citoplásmica y/o capacitancia de la membrana. En función de los resultados de la medición, el dispositivo puede programarse para parametrizar un dispositivo de eyección caso por caso. Cuando se detecta una partícula que verifica los criterios específicos, se aplica un impulso de presión al segundo canal y se expulsa una gota a través del orificio de eyección.

De acuerdo con el documento US 2008/0286751 A1, las células o partículas se suministran en un canal principal, mientras que el orificio de inyección está dispuesto en un segundo canal. Por lo tanto, las células o partículas se suministran en una corriente perpendicular a la abertura del dispensador, que necesita unos elementos de enfoque de flujo de microfluidos adicionales y un equipo de control de flujo externo como unas bombas de alta precisión. Esto aumenta la complejidad de todo el aparato y necesita de volúmenes considerables de suspensión celular para cebar 20 el aparato completo. El flujo transversal en estrecha proximidad del orificio conduce, además, a la desventaja de que el diseño del orificio se ve comprometido con respecto al proceso de generación de gotas. En particular, el volumen de líquido encerrado entre el orificio y la fuente de presión aplicada para el accionamiento es mayor que para la mayoría de otros dispositivos de dispensación de acuerdo con el estado de la técnica, y los canales de flujo cruzado proporcionan rutas de escape adicionales para el líquido a expulsarse fuera del orificio.... [Seguir leyendo]

1. Un aparato para dispensar una o más células o partículas (48) confinadas en una gota en vuelo libre (52) , que comprende:

un dispositivo de generación de gotas de activación piezoeléctrica (10) configurado para expulsar fuera de un orificio (14; 44) una gota en vuelo libre de una suspensión (46) de células o partículas (48) , comprendiendo dicho dispositivo de generación de gotas (10) un canal unidireccional sin ramificar (12; 56) que tiene la abertura del orificio (14; 44) en un extremo del mismo;

un dispositivo (16, 18) de detección de información sobre células o partículas localizadas en un volumen de 10 observación (50) de la suspensión (46) dentro del canal unidireccional sin ramificar (12; 56) ; y medios (20; 110; 120; 130; 140) para dirigir una gota expulsada (52) a una primera posición o a una segunda posición en función de la información detectada, caracterizado por que el dispositivo de generación de gotas de activación piezoeléctrica (10) es un dispositivo de generación de gotas a demanda de activación piezoeléctrica (10) . 15

2. El aparato de la reivindicación 1, en el que el volumen de observación (50) es un volumen de la suspensión que está localizado adyacente al orificio (14; 44) y que se expulsa como una gota en vuelo libre (52) en el siguiente evento de dispensación.

3. El aparato de la reivindicación 1, en el que la primera posición es una posición de destino y la segunda posición es una posición de residuos.

4. El aparato de una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la información sobre las células o partículas comprende al menos una de entre una presencia, un número, un tamaño, un color y/o una impedancia de las células o 25 partículas.

5. El aparato de una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos medios para dirigir están configurados para dirigir una gota expulsada a la primera posición si la información detectada indica que la gota expulsada incluirá un número predeterminado de células o partículas y para dirigir y expulsar la gota a la segunda posición si la información 30 detectada indica que la gota expulsada no incluirá el número predeterminado de células o partículas.

6. El aparato de la reivindicación 5, en el que el número predeterminado es uno.

7. El aparato de una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos medios para dirigir comprenden una plataforma 35 motorizada (20; 110; 122) configurada para mover el dispositivo de generación de gotas (10) o uno o más portadores (26, 114) que llevan a la posición primera y/o segunda, y/o medios (140) que desvían de manera neumática, eléctrica o magnética una gota expulsada del dispositivo de generación de gotas (10) .

8. El aparato de la reivindicación 7, en el que dichos medios para dirigir comprenden un obturador (130) que 40 comprende la segunda posición y medios para colocar el obturador (130) entre el dispositivo de generación de gotas (10) y la primera posición (114) y para retirar el obturador de un espacio entre el dispositivo de generación de gotas (10) y la primera posición (114) .

9. El aparato de una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el dispositivo de generación de gotas comprende 45 medios de enfoque (54, 60) para hacer que las células o partículas vivas fluyan de una en una a través del volumen de observación (50) , y en el que dichos medios de enfoque comprenden al menos uno de entre:

un canal (42) que comprende una sección transversal ahusada hacia el orificio (44) ; y un canal central (68) y dos canales laterales (72) que entran en el canal central (68) en posiciones opuestas. 50

10. El aparato de una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dispositivo de detección comprende al menos uno de entre un sensor de impedancia localizado dentro del dispositivo de generación de gotas y un sensor óptico localizado dentro o fuera del dispositivo de generación de gotas.

11. Un método para dispensar una o más células o partículas confinadas en una gota en vuelo libre, que comprende:

llenar un dispositivo de generación de gotas a demanda de activación piezoeléctrica (10) con una suspensión (46) que comprende células o partículas (48) , comprendiendo el dispositivo de generación de gotas (10) un canal unidireccional sin ramificar (12; 56; 62, 64) que tiene un orificio (14; 44) en un extremo del mismo; 60

detectar información sobre las células o partículas localizadas en un volumen de observación (50) de la suspensión (46) dentro del canal unidireccional sin ramificar; y expulsar una gota (52) fuera del orificio (14; 44) a una posición primera o segunda (22, 24; 112; 114; 130; 140) en función de la información detectada, caracterizado por que el dispositivo de generación de gotas de activación piezoeléctrica (10) es un dispositivo de generación de gotas a demanda de activación piezoeléctrica (10) .

12. El método de la reivindicación 11, que comprende contar un número de células o partículas que pasan a través de la región de observación dentro de un período específico de tiempo en base a la información detectada. 5

13. El método de una de las reivindicaciones 11 y 12, en el que la información detectada comprende una propiedad de las células o partículas y en el que el método comprende clasificar al menos dos tipos diferentes de células o partículas en función de la propiedad detectada expulsando células o partículas que tienen una primera propiedad a una primera localización de destino y células o partículas que tienen una segunda propiedad diferente a una 10 segunda localización de destino.

14. El método de la reivindicación 13, en el que las localizaciones de destino son diferentes pocillos de una placa de multipocillos.

15. Un producto de programa que comprende un código de programa ejecutable en un dispositivo informático, en el que el código de programa es eficaz para derivar la información sobre las células o partículas de una salida de un dispositivo sensor y para controlar un aparato para realizar un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 14.