Anticuerpos específicos para protofibrillas solubles de péptido beta amiloide y usos de los mismos.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a protofibrillas de Aß42 de tipo silvestre y a protofibrillas de Aß42 con baja reactividad cruzada del monómero Aß42 donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se puede obtener mediante el uso de protofibrillas de Aß42Arc o Aß42wt con una pureza superior al 95 % para inmunización y detección selectiva.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/SE2005/000993.

Solicitante: BioArctic Neuroscience AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: Warfvinges väg 39 112 51 Stockholm SUECIA.

Inventor/es: GELLERFORS, PAR, LANNFELT,Lars.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/395 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61P25/28 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 25/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso. › de los problemas neurodegenerativos del sistema nervioso central, p. ej. noótropos, activadores del conocimiento, medicamentos para el tratamiento del Alzheimer o de otras formas de demencia.
  • C07K14/47 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
  • C07K16/18 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.

PDF original: ES-2537001_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Anticuerpos específicos para protofibrillas solubles de péptido beta amiloide y usos de los mismos

1. Campo de ¡a invención

La presente invención se refiere al diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en particular la enfermedad de Alzheimer, y otras enfermedades similares. Más precisamente, a anticuerpos que se unen específicamente a la proteína beta amiloide (AB) en su conformación de protofibrillas, tal como se define en las reivindicaciones.

2. Antecedentes de ia invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo e irreversible que causa cognitiva, alteraciones cognitivas, de la memoria y del comportamiento. Es la causa más común de demencia en la población anciana que afecta a aproximadamente el 5 % de la población mayor de 65 años y al 20 % por encima de los 80 años de edad. La EA se caracteriza por un inicio insidioso y un deterioro progresivo de múltiples funciones cognitivas. La neuropatología involucra a los depósitos proteináceos argirofílicos tanto extracelulares como ¡ntracelulares. Los depósitos extracelulares, denominados placas neuríticas, consisten principalmente en la proteína beta amiloide (AB) rodeada de neuritas distróficas (procesos neuronales inflamados distorsionados). Los AB dentro de estos depósitos extracelulares son fibrilares en su carácter con una estructura de lámina [3 plegada. Los AB en estos depósitos se pueden teñir con ciertos colorantes, por ejemplo, Rojo Congo, y mostrar una ultraestructura fibrilar. Estas características, adoptada por el AB en su estructura fibrilar de las placas neuríticas, son la definición de la término genérico amiloide. La lesión patológica de la EA intracelular clásica es la maraña neurofibrilar (NFT), que consiste en estructuras filamentosas llamados filamentos helicoidales emparejados (PHF) compuestas por hebras retorcidas de la proteína tau asociada a los microtúbulos hiperfosforilados. Las placas neuríticas frecuentes y los depósitos de marañas neurofibrilares en el cerebro son los criterios diagnósticos de la EA, observados en la autopsia. Los cerebros de EA también muestran atrofia macroscópica del cerebro, pérdida de células nerviosas, inflamación local (microgliosis y astrocitosis) y a menudo angiopatía amiloide congofílica (CAA) en las paredes de los vasos cerebrales.

Dos formas de péptidos AB, AB40 y AB42, son la especie dominante en las placas neuríticas de EA (Masfers 1985), mientras que AB40 es la especie prominente en el amiloide cerebrovascular asociado con la EA (G/enner 1984). Las actividades enzimáticas permiten al AB que se forme continuamente a partir de una proteína más grande llamada la proteína precursora de amiloide (APP) tanto en sujetos sanos como en afectados por EA en todas las células del cuerpo. Dos importantes acontecimientos de procesamiento de APP a través de las actividades [3- y y-secretasa permiten la producción de AB, mientras que las actividades de una tercera enzima llamada a-secretasa impide la generación por escisión dentro de la secuencia de AB (Selkoe, 1994; US5604102). El AB42 es un péptido de cuarenta de dos aminoácidos de longitud, es decir, dos aminoácidos más largo en el extremo C-terminal, en comparación con AB40. AB42 es más hidrofóbico, y se agrega más fácilmente en estructuras más grandes de péptidos AB tales como dímeros AB, tetrámeros AB, oligómeros AB, protofibrillas AB o fibrillas AB. Las fibrillas AB son hidrófobas e ¡nsolubles, mientras que las otras estructuras son todo menos hidrofóbicas y solubles. Todas estas estructuras moleculares más altas de los péptidos AB se definen individualmente en función de su aspecto biofísico y estructural, por ejemplo en microscopía electrónica, y sus características bioquímica, por ejemplo, mediante el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño / de transferencia de tipo western. Estos péptidos AB, particularmente AB42, se ensamblarán poco a poco en diversas estructuras moleculares más altas de AB durante el período de vida. La EA, que es un trastorno fuertemente dependiente de la edad, se producirá antes en la vida si este proceso de ensamblaje se produce más rápidamente. Este es el núcleo de la "hipótesis de la cascada amiloide" de la EA que afirma que el procesamiento de APP, los niveles de AB42 y su ensamblaje en estructuras moleculares más altas es una causa central de la EA. El resto de la neuropatología del cerebro con EA y los síntomas de la EA, como la demencia, se deben de alguna manera al AB o a las formas ensambladas del mismo.

AB puede existir en diferentes longitudes, es decir, 1-39,1-40,1-42 y 1-43 y tamaños de fragmentos, es decir, 1-28, 3-40 / 42, 11-40 / 42, 17-40 / 42 y 25- 35. Todos estos péptidos pueden agregarse y formar intermedios solubles y fibrillas ¡nsolubles, teniendo cada forma molecular una conformación estructural única y la propiedad biofísica. Por ejemplo, el A)31-42 monomérico, es un péptido soluble y no tóxico de 42 aminoácidos, que se sugerido que participa en las funciones normales de la sinapsis. Bajo ciertas condiciones, el A)31-42 puede agregarse en dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros hasta 12 unidades y formas oligoméricas superiores, todos con su propiedad fisicoquímica distinta tales como el tamaño molecular, la estructura EM y la forma molecular en AFM (microscopía de fuerza atómica). Un ejemplo de una forma de AB oligomérica soluble de peso molecular más alto es el de las protofibrillas (T/arí/ey 1999, waa/s 1999), que tiene un peso molecular aparente> 100 kDa kDa y una estructura curvilínea de 4-11 nm de diámetro y <200 nm de longitud. Recientemente se ha demostrado que los péptidos AB solubles oligoméricos tales como las protofibrillas AB perjudican a la potenciación a largo plazo (LTP)) (Harf/ey, 1999), medida de la plasticidad sinóptica que se cree que refleja la formación de la memoria en el hipocampo (Wá/sñ 2001). Además, oligómeros péptidos AB Arctic muestran mucho un efecto inhibidor de wtAp sobre LTP en el cerebro mucho más profundo, probablemente debido a su fuerte propensión a formar protofibrillas AB (K/ytró/n 2003).

También hay otras formas oligoméricas solubles descritas en la literatura que son claramente diferentes de las protofibrillas. Un de estas formas oligoméricas es ADDL (ligando difundible derivado de amiloide) (Lamóerí 1998). El análisis AFM de ADDL reveló especies globulares predominantemente pequeñas de 4,7 a 6,2 nm a lo largo del eje z con pesos moleculares de 17-42 kDa. (Sf/ne 1996). Otra forma se denomina ASPD (amiloidesferoides). Los ASPD son oligómeros esféricos de AB1-40. Los estudios de toxicidad mostraron que los ASPD esféricos > 10 nm eran más tóxicos que las formas moleculares inferiores (/Vos/?/ 2003). Las fibrillas AB como la principal especie neurotóxica es incompatible con la pobre correlación entre la densidad de la placa neurítica y la puntuación de la demencia por EA y también con los modestos signos de neurodegeneración en ratones transgénicos APP actuales. Especies intermedias de AB solubles neurotóxicas y su sitio subcelular apropiado de formación y distribución podría ser el eslabón perdido que mejor explique la hipótesis del amiloide. Esta ¡dea ha ganado apoyo por el reciente descubrimiento de la mutación Arctic (E693) de APP, que provoca EA de aparición temprana (US 2002/0162129 A1; Nilsberth y col., 2001). La mutación se encuentra dentro de la secuencia de péptidos AB. De este modo, los portadores de la mutación generarán variantes de los péptidos AB por ejemplo, Arctic AB40 y Arctic Ap42. Tanto Arctic AB40 como Arctic Ap42 se ensamblarán con mucha mayor facilidad en estructuras moleculares más altas (protofibrillas) que son solubles y no fibrilares. Por tanto, el mecanismo patogénico de la mutación Arctic sugiere que las protofibrillas solubles moleculares más altas producen EA.

2. 1 Diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer

2.1.1 Diagnóstico clínico

El diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer (e) es difícil de hacer, especialmente en las primeras etapas de la enfermedad. Hoy en día, el diagnóstico se basa en la historia clínica típica combinada con la exclusión de otras causas de demencia. Los centros clínicos con alta especialización pueden tener una precisión diagnóstica del 85-90 % en comparación con el diagnóstico neuropatológico. En las primeras etapas de la enfermedad, el cuadro clínico es vago y todavía no se han identificado marcadores de diagnósticos definitivos (McKbann 7984,). El desarrollo de marcadores diagnósticos bioquímicos es importante por varias razones: para apoyar el diagnóstico clínico, para permitir a los médicos dar información adecuada a los pacientes y a sus familiares,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a protofibrillas de AB42 de tipo silvestre y a protofibrillas de AB42 con baja reactividad cruzada del monómero AB42 donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se puede obtener mediante el uso de protofibrillas de AB42Arc o AB42wt con una pureza superior al 95 % para inmunización y detección selectiva.

2. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede detectar tanto protofibrillas de AB42 de tipo silvestre como protofibrillas de Arctic Ap en un ELISA en el intervalo de concentración de 1000-10 ng/ml.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede detectar tanto protofibrillas de AB42 de tipo silvestre como protofibrillas de Arctic Ap en un ELISA en el intervalo de concentración de 1000-0,1 ng/ml.

4. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho anticuerpo es policlonal.

5. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho anticuerpo es monoclonal (AcMo).

6. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se ha producido contra protofibrillas que comprenden dichos péptidos Ap que contienen una o varias mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en la mutación Arctic G22E, la mutación holandesa E22Q, la mutación flamenca A21G, la mutación italiana E22K, la mutación de lowa D23N y combinaciones de las mismas.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es humano o ha sido humanizado.

8. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el anticuerpo o fragmento del mismo está marcado.

9. Una composición que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. La composición de la reivindicación 9 que comprende además un vehículo o excipiente.

11. Un método de detección de protofibrillas AB in vitro, que comprende las etapas de:

- marcar el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 con un agente que puede generar una señal medible;

- añadir dicho anticuerpo marcado o composición que comprende un anticuerpo a una muestra biológica que comprende o se sospecha que comprende protofibrillas AB;

- medir la concentración del complejo formado entre dicha protofibrilla AB y dicho anticuerpo o fragmento del mismo.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho método de detección es un inmunoensayo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho ensayo de unión de proximidad.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde dicha muestra biológica se selecciona de plasma, LCR, cerebro y otros tejidos de origen animal o humano.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde el anticuerpo o fragmento del mismo está marcado con marcadores radiactivos, ADN, moléculas fluorescentes, o enzimas que convierte un sustrato de tal manera que su absorbancia se puede medir.

16. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down.

17. Un método para /a detección selectiva /n v/fro de sustancias que inhiben o modulan los niveles de protofibrillas AB y / o la actividad en cultivos de células, que comprende las etapas de:

- administrar posibles fármacos candidatos a un cultivo celular,

- administrar un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 marcado con un agente que puede generar una señal medióle, a dicho cultivo celular,

- evaluar el efecto de dichos fármacos candidatos mediante la medición de la cantidad de protofibrillas unidas al anticuerpo o fragmento del mismo mediante la medición de la señal generada por el agente.

18. Un método de diagnóstico o monitorización de la enfermedad de Alzheimer (EA) o el síndrome de Down, que comprende las etapas de:

- añadir el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 a una muestra biológica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene EA o síndrome de Down,

- medir la cantidad de protofibrillas unidas al anticuerpo o fragmento del mismo utilizando ELISA, RIA, transferencia de Western, transferencia de mancha o unión por proximidad.

19. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en un método de diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método:

- marcar el anticuerpo o fragmento del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 con un agente que puede generar una señal medible;

- añadir dicho anticuerpo marcado a una muestra tomada de un sujeto; y

- medir la concentración del complejo formado entre dicho anticuerpo o fragmento del mismo y cualquier protofibrilla A)3 en dicha muestra.

20. Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en un método de diagnosticar el síndrome de Down, la demencia con cuerpos de Lewy o demencia vascular, comprendiendo el método:

- marcar el anticuerpo o fragmento del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 con un agente que puede generar una señal medible;

- añadir dicho anticuerpo marcado a una muestra tomada de un sujeto; y

- medir la concentración del complejo formado entre dicho anticuerpo o fragmento del mismo y cualquier protofibrilla A[3 en dicha muestra.


 

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