ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencias 3''.

ADN polimerasa que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% respecto a SEC ID nº 1 y que presenta una actividad incrementada de discriminación de no correspondencias 3' en comparación con una ADN polimerasa de control,

en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-K-X2-T-X3-X4-D-P-L-P, en la que:

X2 es S o N,

X3 es C o N,

y X4 es V o I (SEC ID nº 11),

y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID nº 1 es G y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido X3 de la ADN polimerasa de control es Y.

ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencias 3'

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente Invención proporciona ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencia 3' y su utilización en diversas aplicaciones, incluyendo la extensión y amplificación de polinucleótidos de ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y mantenimiento del genoma, un papel que es crucial para transmitir con precisión la información genética de generación a generación. Las ADN polimerasas funcionan en las células como los enzimas responsables de la síntesis del ADN. Polimerizan los desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde polinucleótido que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un abanico de procesos de síntesis del ADN, incluyendo la replicación del ADN, la reparación del ADN, la recombinación y la amplificación génica. Durante cada proceso de síntesis de ADN, se copia el molde de ADN una vez o como máximo unas pocas veces, produciendo réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación del ADN puede repetirse muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.683.22).

En los estudios iniciales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se añadía la ADN polimerasa al inicio de cada ronda de replicación del ADN (ver la patente US n° 4.683.22, in vivo). Posteriormente se determinó que las ADN polimerasas termoestables podían obtenerse de bacterias que crecen a temperaturas elevadas, y que estos enzimas sólo necesitan añadirse una vez (ver las patentes US n° 4.889.818 y n° 4.965.188). A las elevadas temperaturas utilizadas durante la PCR, estos enzimas no resultan inactivados irreversiblemente. En consecuencia, pueden llevarse a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de polimerasa sin añadir enzimas frescos al inicio de cada proceso de adición sintética. Las ADN polimerasas, en particular las polimerasas termoestables, son la clave para un gran número de técnicas en estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de enfermedades. Para las aplicaciones diagnósticas en particular, una secuencia diana de ácidos nucleicos puede ser meramente una porción pequeña del ADN o ARN en cuestión, de manera que puede resultar difícil detectar la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos sin la amplificación.

El patrón de pliegue global de las ADN polimerasas es similar al de la mano derecha humana y contiene tres subdominios diferentes de palma, dedos y pulgar (ver Beese et al., Science 26:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995). Aunque la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varían mucho entre polimerasas que difieren en el tamaño y en las funciones celulares, los subdominios de palma catalíticos son todos superponibles. Por ejemplo, el motivo A, que interactúa con el dNTP entrante y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es superponible con una desviación promedio de aproximadamente un A entre la pol a de mamíferos y las ADN polimerasas de la familia procariótica de pol I (Wang et al., Cell 89:187-199, 1997). El motivo A se inicia estructuralmente en una cadena (3 antiparalela que contiene predominantemente residuos hidrofóbicos y continúa a una hélice a. La secuencia de aminoácidos primaria de los sitios activos de la ADN polimerasa se encuentra excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID n° 28) se conserva en las polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, entre ellos, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli.

Además, de estar bien conservado, el sitio activo de las ADN polimerasas también ha demostrado ser relativamente mutable, capaz de ajustarse a determinadas sustituciones de aminoácidos sin reducir significativamente la actividad de la ADN polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.62.695). El documento n° WO 28/46612 da a conocer ADN polimerasas Z5 que comprenden una mutación del residuo aminoácido D en residuo aminoácido G en la posición 58, que presentan tasas de extensión mejoradas en comparación con una polimerasa no modificada correspondiente. Dichas ADN polimerasas mutantes puede ofrecer diversas ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos. De esta manera, existe una necesidad en la técnica de identificar las posiciones de aminoácidos que pueden mutarse para rendir actividades mejoradas de polimerasa. La presente invención, tal como se proporciona en la presente memoria, satisface ésta y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

En la presente memoria se proporcionan ADN polimerasas que presentan una discriminación incrementada de no correspondencias 3' en comparación con una polimerasa de control no modificada correspondiente, y métodos de preparación y utilización de estas ADN polimerasas. En algunas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoactiva. Una ADN polimerasa según la invención presenta una identidad de secuencia de por lo menos 8% respecto a SEC ID n° 1 y presenta una actividad de discriminación incrementada de no correspondencias 3' en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que

comprende K-L-K-X2-T-X3-X4-D-P-L-P, en el que X2 es S o N, X3 es C o N, y X4 es V o I (SEC ID n° 11) y en la que el aminoácido de la ADN pollmerasa correspondiente a la posición 58 de SEC ID n° 1 es G, y en la que la ADN pollmerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido X3 de la ADN pollmerasa es Y. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa se deriva de una especie de Thermus. También se da a conocer que la ADN polimerasa se deriva de una especie de Thermotoga. Se da a conocer además que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de Y, y que la ADN pollmerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN pollmerasa excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es Y. Por ejemplo, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 se selecciona de entre G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, N, Q, D, E, K, R o H. Se da a conocer además que el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es un aminoácido que presenta una cadena lateral sin carga no polar (por ejemplo G, A, L, M, W, P, F, C, V o I) o una cadena lateral sin carga polar (por ejemplo N, Q, H, S o T). En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es C o N. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es C. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 547 de SEC ID n° 1 es N.

Se da a conocer además que la ADN polimerasa que presenta una discriminación incrementada de la no correspondencia 3' comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-X1-X2-T-X3-X4-X5-X6-X7- X8, en la que:

X1 es K, R o Q, X2 es N, S o G,

X3 es cualquier residuo aminoácido diferente de Y,

X4 es V, I o L,

X5 es D o E,

Xs es P, A, T, S o G,

Xyes L o I,

y X8 es P o L (SEC ID n° 8).

Se da a conocer además que X3 se selecciona de entre G, A, L, M, W, P, S, T, F, C, N, Q, D, E, K, R, V, I or H (SEC

ID n° 42).

Se da a conocer además que la ADN polimerasa que presenta una discriminación incrementada de la no correspondencia 3' comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-X1-X2-T-X3-X4-D-X6-L-P, en el que:

X2 es N o S,

Xb es cualquier residuo aminoácido diferente de Y,

X4es V o I,

y X6 es P o A (SEC ID n° 9).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa que presenta una discriminación incrementada de la no correspondencia 3' comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-K-X2-T-X3-X4-D-P-L-P, en el que:

X2 es N o S,

Xjes C o N,

y X4 es V o I (SEC ID n° 11).

Se da a conocer además que X3 es un aminoácido que presenta una cadena lateral sin carga no polar (por ejemplo C, I, L, M, F, P, W... [Seguir leyendo]

1. ADN polimerasa que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 8% respecto a SEC ID n° 1 y que presenta una actividad incrementada de discriminación de no correspondencias 3' en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-K-X2-T-X3-X4-D-P-L-P, en la que:

X2es S o N,

X3es C o N,

y X4 es V o I (SEC ID n° 11),

y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 58 de SEC ID n° 1 es G y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido X3 de la ADN polimerasa de control es Y.

2. ADN polimerasa según la reivindicación 1, en la que la polimerasa presenta una identidad de secuencia de por lo menos 9%, más preferentemente de por lo menos 95%, respecto a SEC ID n° 1.

3. ADN polimerasa según la reivindicación 2, en la que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z5.

4. Ácido nucleico recombinante codificante de la ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Método para llevar a cabo la extensión de cebadores, que comprende:

poner en contacto una ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un cebador, un molde polinucleótido y nucleósidos trifosfato bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido.

6. Kit para producir un cebador extendido, que comprende:

por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Kit según la reivindicación 6, que comprende además uno o más recipientes adicionales seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un molde polinucleótido predeterminado,

(b) un recipiente que proporciona nucleótidos trifosfato, y

(c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión de cebadores.

8. Mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, por lo menos un cebador, un molde polinucleótido y nucleósidos trifosfato.