ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3'' aumentada.

Un ADN polimerasa que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la SEC ID Nº:

1 y que tiene actividad de diferenciación de desapareamientos 3' aumentada en comparación con un ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende

A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-E-R-V-L-X13-D-E-L, en el que:

X13 es A, G, S, T, Y, D o K (SEC ID Nº: 11), y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido X13 de la ADN polimerasa de control es F.

ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3 aumentada Campo de la invención

La presente invención proporciona ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3 aumentada y su uso en diversas aplicaciones, incluyendo extensión y amplificación de polinucleótidos de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y el mantenimiento del genoma, un papel que es central para la transmisión precisa de la información genética de generación en generación. Las ADN polimerasas actúan en células como las enzimas responsables de la síntesis de ADN. Polimerizan desoxirribonucleósido trifosfatos en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde polinucleotídico que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un espectro de procesos sintéticos de ADN incluyendo replicación de ADN, reparación de ADN, recombinación y amplificación génica. Durante cada proceso sintético de ADN, el molde de ADN se copia una vez o como máximo varias veces para producir réplicas idénticas. Por el contrario, in vitro, la replicación de ADN puede repetirse muchas veces tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la pollmerasa (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.683.22).

Los estudios Iniciales con reacción en cadena de la pollmerasa (PCR), la ADN polimerasa se añadió al comienzo de cada ciclo de replicación de ADN (véase Patente de Estados Unidos N° 4.683.22, mencionado anteriormente). Posteriormente, se determinó que podrían obtenerse ADN polimerasas termoestables a partir de bacterias que crecen a temperaturas elevadas, y que es necesario añadir estas enzimas solamente una vez (véase Patente de Estados Unidos N° 4.889.818 y Patente de Estados Unidos N° 4.965.188). A las temperaturas elevadas usadas durante la PCR, estas enzimas no se inactivan de forma Irreversible. Como resultado, se pueden llevara cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la pollmerasa sin añadir nuevas enzimas al comienzo de cada proceso de adición sintético. Las ADN polimerasas, particularmente polimerasas termoestables, son la clave de un gran número de técnicas en estudios de ADN recombinantes y en diagnóstico médico de la enfermedad. Para aplicaciones de diagnóstico en particular, una secuencia de ácido nucleico diana puede ser solamente una pequeña parte del ADN o ARN en cuestión, de modo que puede ser difícil detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana sin amplificación.

El patrón de plegamiento general de las ADN polimerasas se asemeja a la mano derecha humana y contiene tres subdominios distintos de palma, dedos y pulgar (véase Beese et al., Science 26: 352-355, 1993; Patel et al., Biochemlstry 34:5351-5363, 1995). Aunque la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varían en gran medida entre las polimerasas que difieren en tamaño y en funciones celulares, los subdominios de palma catalíticos son todos superponibles. Por ejemplo, al motivo A, que interacciona con el de dNTP entrante y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, puede superponerse con una desviación media de aproximadamente un A entre las ADN polimerasas de la familia pol a de mamífero y pol I procarlota (Wang et al., Cell 89: 187-199, 1997). El motivo A comienza estructuralmente en una cadena p antiparalela que contienen restos predominantemente hidrófobos y continúa hasta una hélice a. La secuencia de aminoácidos primaria de sitios activos de ADN polimerasa está excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID N°: 28) se conserva en polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, incluyendo, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escheríchia coli.

Además de estar bien conservado, se ha mostrado que el sitio activo de ADN polimerasas es relativamente mutable, capaz de acomodar ciertas sustituciones de aminoácidos sin reducir la actividad ADN polimerasa significativamente (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.62.695). El documento WO 28/46612 desvela ADN polimerasas Z5 que comprenden una mutación del resto de aminoácido D al resto de aminoácido G en la posición 58 que tienen tasas de extensión mejoradas en relación con una polimerasa no modificada, correspondiente. Dichas ADN polimerasas mutantes pueden ofrecer diversas ventajas selectivas, por ejemplo, en las aplicaciones de diagnóstico e investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácido nucleico. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de identificar posiciones de aminoácidos susceptibles de mutación para producir actividades polimerasa mejoradas. La presente invención, como se expone en el presente documento, cumple estas y otras necesidades.

Breve sumario de la invención

Se proporcionan en el presente documento ADN polimerasas que tienen diferenciación de desapareamientos 3 aumentada en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente, y métodos para preparar y usar dichas ADN polimerasas. En algunas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoactiva. Una ADN polimerasa de acuerdo con la invención tiene al menos 8 % de identidad de secuencia con la SEC ID N°: 1 y tiene actividad de diferenciación

de desapareamiento 3 aumentada en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-E-R-V-L-X-is-D-E-L, en la que:

Xi3 es A, G, S, T, Y, D, o K (SEC ID N°: 11), y en la que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido X13 de la ADN polimerasa de control es F. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa deriva de una especie de Thermus. También se desvela que la ADN polimerasa deriva de una especie de Thermotoga.

Como se describe en el presente documento, de acuerdo con la invención el aminoácido de una ADN polimerasa correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 puede mutarse del aminoácido nativo en esa posición para producir una enzima que tenga diferenciación de desapareamlentos 3 aumentada en relación con una polimerasa de control no modificada, correspondiente. En ADN pollmerasas derivadas de una especie de Thermus, el aminoácido nativo correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es F. En ADN pollmerasas derivadas de una especie de Thermotoga, el aminoácido nativo correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es F. En ADN pollmerasas derivadas de otras especies no Thermus, no Thermotoga, el aminoácido correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 puede ser F o un aminoácido distinto de F, por ejemplo, Y. Véase, Figura 1.

También se desvela que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es cualquier aminoácido distinto de F o Y, y la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es F o Y. Por ejemplo, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 se selecciona de G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, N, Q, D, E, K, R o H. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 se selecciona de A, G, S, T, D o K. También se desvela que la ADN polimerasa de la invención deriva de una especie de Thermus, y el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es cualquier aminoácido distinto de F, y la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es F. Por ejemplo, cuando la ADN polimerasa deriva de una especie de Thermus, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 puede seleccionarse de G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, N, Q, D, E, K, R, H o Y. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 se selecciona de A, G, S, T, Y, D o K. En algunas realizaciones el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 se selecciona de A, G, S, T, D o K.

También se desvela que la ADN polimerasa de la invención deriva de una especie de Thermus, y el aminoácido correspondiente a la posición 497 de SEC ID N°: 1 es un aminoácido que tiene una cadena lateral polar, sin carga (por ejemplo, N, Q, H, S, T o Y),... [Seguir leyendo]

1. Un ADN polimerasa que tiene al menos 8 % de identidad de secuencia con la SEC ID N°: 1 y que tiene actividad de diferenciación de desapareamientos 3 aumentada en comparación con un ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende

A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-E-R-V-L-X13-D-E-L, en el que:

Xi3 es A, G, S, T, Y, D o K (SEC ID N°: 11), y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido X-|3 de la ADN polimerasa de control es F.

2. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 58 de la SEC ID N°: 1 es cualquier aminoácido distinto de D o E.

3. La ADN polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 58 de la SEC ID N°: 1 se selecciona del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K.

4. La ADN polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la polimerasa tiene al menos 9 %, más preferentemente al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEC ID N°: 1.

5. La ADN polimerasa de la reivindicación 4, en la que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z5, y el aminoácido en la posición 58 se selecciona del grupo que consiste en L, G, T, Q, A, S, N, R y K.

6. Un ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un método para realizar extensión de cebadores, que comprende:

poner en contacto una ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con un cebador, un molde polinucleotídico, y nucleósido trifosfatos, en condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido.

8. Un kit para producir un cebador extendido, que comprende:

al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además uno o más recipientes adicionales seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, en condiciones de extensión de cebadores, con un molde polinucleotídico predeterminado;

(b) un recipiente que proporciona nucleósido trifosfatos; y

(c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión de cebadores.

1. Una mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, al menos un cebador, un molde polinucleotídico y nucleósido trifosfatos.