Administración de vectores lentivirales al cerebro.

Un vector lentiviral para la administración al putamen para su uso en el tratamiento de una afección neurológica,

en el que una composición que comprende el vector lentiviral se administra directamente al putamen por infusión continua usando una cánula y en el que se administran entre 10-600 &mul de la composición de vector por tramo a una velocidad de flujo de al menos 2 μl/min, y en el que el vector lentiviral se administra usando una cánula con una perforación equivalente o más estrecha de aproximadamente 28 de calibre.

Administración de vectores lentivirales al cerebro Campo de la invención

La presente invención se refiere a un vector lentiviral para la administración al cerebro para su uso en el tratamiento de una afección neurológica. El vector lentiviral se administra directamente al cerebro por infusión continua usando un dispositivo de administración de perforación estrecha con un número reducido de puntos de depósito en comparación con los métodos previos.

Antecedentes a la invención

Se conocen enfoques basados en virus para tratar diversas enfermedades neurológicas, mediante la introducción de genes terapéuticos para transducir células neuronales y/o de soporte. Por ejemplo, se ha desarrollado un producto de vector lentiviral multicistrónico, ProSavin®, para tratar enfermedad de Parkinson. ProSavin® media en la producción de dopamina intraestriatal transduciendo en células de no dopamina los genes para L-aminoácido aromático descarboxilasa, tirosina hidroxilasa y GTP ciclohidrolasa 1 (Azzouz et al. (22) J Neurosci,22: 132- 1312).

Métodos previos de administración de vectores lentivirales han introducido los vectores en regiones específicas dentro del cerebro mediante múltiples depósitos de pequeño volumen a una baja velocidad de flujo discontinua para garantizar la transducción suficiente de células diana sobre una amplia área (Azzouz et al. (22) J Neurosci 22: 132-1312). Por ejemplo, ProSavin® se administra usando múltiples tramos (hasta 5 por hemisferio) usando un método de administración escalonada que implica múltiples depósitos del vector a lo largo de cada tramo (Jarraya et al. (29) Sci Transí Med 14: 1(2) 2-4).

Un enfoque tal requiere planificación pre-quirúrgica compleja para determinar el posicionamiento de los tramos de cánula y cirugía que requiere mucho tiempo, con un elevado riesgo de hemorragia y otras complicaciones quirúrgicas asociadas al uso de múltiples tramos de cánulas para introducir el vector.

Así, existe la necesidad de métodos de administración mejorados para tales vectores lentivirales.

Hay informes de uso de administración potenciada por convección (CED) como un método eficaz de administración de agentes terapéuticos, que incluye nanopartículas de magemita, liposomas y vectores virales pequeños, tales como vectores de virus adeno-asociados (AAV), en el cerebro (Lieberman et al. (1985) J. Neurosurg. 82:121-129; Bankiewicz et al. (2) Exp. Neurol. 164:2-14; Cunningham et al. (2) Cell Transplant 9:585-594; Nguyen et al. (21) Neuroreport 12:1961-1964; Mamot et al. (24) J Neurooncol. 68:1-9; Hadaczek et al. (26) Hum. Gene Ther 17:291-32 y Perlstein et al. (28) Neuro-Oncol 1:153-161). Usando un infundido presurizado, se ha informado que la distribución de partículas y macromoléculas a través del espacio perivascular se potencia por encima de la alcanzada por la difusión sola (Chen et al. (24) J. Neurosurg. 11:314-322 y Hadaczek et al. (29) Hum. Gene Ther 2:229-237).

CED usa un gradiente de presión establecida en la punta de un catéter de infusión que inicialmente crea flujo global que "empuja" el agente terapéutico a través del espacio entre las células del cerebro.

Aunque hay informes de uso satisfactorio de CED para administrar AAV pequeños (Bankiewicz et al. (2) Exp. Neurol. 164:2-14; Cunningham et al. (2) Cell Transplant 9:585-594; y Hadaczek et al. (29) Hum. Gene Ther 2:229-237), estos hallazgos tienen poco impacto sobre la administración de vectores lentivirales, debido a que se ha calculado que el espacio intracelular en el cerebro es entre 38 y 64 nm (Thorne y Nicholson (26) PNAS 14; 5567-5572), mientras que el diámetro típico de los lentivirus es aproximadamente 1 nm, normalmente aproximadamente cuatro veces mayor que los vectores de AAV (Fields Virolog, quinta edición (27) Eds. Knipe and Howley. Lippincott Williams and Wilkins). Los vectores de AAV son virus no envueltos con un diámetro de aproximadamente 18-26 nm y son considerablemente más pequeños que el espacio intracelular calculado.

La consideración del tropismo celular (Davidson et al. (2) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 97, PP. 3428-3432; Azzouz et al. (22) J Neurosci 22:132-1312 y Eschemacher et al. (24) Exp Med 9:61-69) es un factor importante cuando se cambia la administración de vector, ya que dianas neuronales u otras celulares pueden comprometerse significativamente cuando los vectores se administran de una forma acelerada. Además, la respuesta inmunológica relativa a la administración de vector central también puede alterarse cuando se modifica la metodología para la administración quirúrgica en regiones del cerebro específicas.

Descripción de las figuras

Figura 1. Tinción para anti-p-galactosidasa en putamen de primate no humano tras la administración de 5 pl de suspensión del vector VAIE-LacZ usando (A) 5 tramos de aguja, administrando cada uno 1 pl en 3 puntos con una

aguja de acero inoxidable Hamilton de calibre 23 (B) una infusión única a 3 |jl/min mediante una cánula de sílice fundida de calibre 28 o (C) infusión de 5 |jl de tampón de formulación TSSM solo mediante una cánula de sílice fundida de calibre 28 a 1 pl/min. Esta figura ilustra la diseminación medio-lateral superior y dorsoventral del vector de VAIE en el putamen tras la administración usando una infusión única (B) en comparación con el método establecido de 5 tramos de aguja (A) en el que el vector está más confinado a la proximidad del tramo de inyección. Las imágenes de gran aumento indican la morfología neuronal de las células transducidas con VAIE que es similar con ambos métodos de administración. La inyección del tampón TSSM proporciona un control negativo para la tinción histológica.

Figura 2. Estimación del volumen de distribución de vector en putamen de primate no humano usando métodos de estereología tras la administración de 5 pl de suspensión del vector VAIE-LacZ usando diferentes métodos de administración.

Los datos ¡lustran que la administración de vector usando una infusión única mediante una cánula de sílice fundida de calibre 28 a una velocidad de flujo constante de tanto 1 como 3 pl/min media en la distribución mejorada del vector en el putamen en comparación con el método de administración de 5 tramos usando una aguja de calibre 23 y jeringa. La mayor velocidad de flujo de 3 pl/min demostró un mayor volumen de distribución del vector con la infusión única que la tasa más lenta. La administración de vector usando una infusión única con la aguja de calibre 23 y jeringa produjeron un menor volumen de distribución del vector que ambos métodos descritos anteriormente que indica que el calibre de la aguja es crítico para conseguir una distribución del vector mejorada en el cerebro.

Figura 3. Fotomicrografías de bajo aumento que muestran tinción positiva para CD68 de microglía activada en secciones que recibieron 5 pl de suspensión del vector VAIE-LacZ usando (A) 5 tramos de aguja con una aguja de acero inoxidable Flamilton de calibre 23 o (B) una infusión única mediante una cánula de sílice fundida de calibre 28. Esta figura ¡lustra que para ambos métodos de administración la respuesta inflamatoria es local y está confinada al área del tramo de la aguja.

Resumen de aspectos de la invención

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que, a pesar del tamaño de vectores lentlvlrales con respecto al espacio extracelular, es posible modificar el método de administración discontinuo de múltiples tramos descrito para ProSavin®, aumentar el volumen administrado por tramo y la velocidad de flujo de infusión para vectores lentivirales que a su vez produce un mayor volumen de diseminación del vector dentro del cerebro.

Usando un vector lentiviral basado en el virus de la anemia Infecciosa equina (VAIE), que expresa el gen Indicador (3-galactosidasa (VAIE-LacZ), han mostrado que una infusión única continua de este vector lentiviral genéticamente modificado se distribuye eficazmente dentro del putamen de macacos clnomolgos. Aunque la diseminación del vector en el eje rostro-caudal del putamen fue marginalmente Inferior a usar el enfoque múltiple de 5 tramos de aguja previamente descrito para diseminar manualmente la distribución del vector, la distribución del vector en los ejes medio-lateral y dorso-ventral con el paradigma de una infusión única continua fue mejor que el enfoque de múltiples depósitos de 5 tramos. Además, el volumen total de distribución del vector en el cerebro fue casi 2 veces mayor con una Infusión única continua en comparación con el método de múltiples depósitos de cinco tramos.

A pesar del elevado volumen y la elevada velocidad de flujo de administración, el sistema de Infusión continua... [Seguir leyendo]

1. Un vector lentiviral para la administración al putamen para su uso en el tratamiento de una afección neurológica, en el que una composición que comprende el vector lentiviral se administra directamente al putamen por infusión continua usando una cánula y en el que se administran entre 1-6 pl de la composición de vector por tramo a una velocidad de flujo de al menos 2 pl/min, y en el que el vector lentiviral se administra usando una cánula con una perforación equivalente o más estrecha de aproximadamente 28 de calibre.

2. Un vector lentiviral según la reivindicación 1, en el que se mantiene una velocidad de flujo constante durante la infusión del vector lentiviral.

3. Un vector lentiviral según la reivindicación 1, en el que la velocidad de flujo se aumenta durante la infusión del vector lentiviral.

4. Un vector lentiviral según cualquier reivindicación precedente, que es un vector del virus de la anemia infecciosa equina (VAIE).

5. Un vector de VAIE según la reivindicación 4, que comprende secuencias de nucleótidos que codifican tirosina hidroxilasa, GTP-ciciohidrolasa 1 y el aminoácido aromático Dopa descarboxilasa.

6. Un vector lentiviral según cualquier reivindicación precedente, en el que la velocidad de flujo a la que el vector se administra es entre 2-4 pl/min.

7. Un vector lentiviral según cualquier reivindicación precedente, en el que la velocidad de flujo a la que el vector se administra es aproximadamente 3 pl/min.

8. Un vector lentiviral según cualquier reivindicación precedente para tratar enfermedad de Parkinson.

9. Un kit para administrar un vector lentiviral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 directamente al putamen del sujeto para su uso en el tratamiento de una afección neurológica, en el que el kit comprende una o más cánulas, en el que la(s) cánula(s) tiene/n aproximadamente 28 de calibre o más estrechas, y en el que, en uso, una composición que comprende el vector lentiviral se administra directamente al putamen por infusión continua usando la cánula y en el que entre 1-6 pl de la composición de vector se administra por tramo a una velocidad de flujo de al menos 2 pl/min.

1. Un kit según la reivindicación 9, en el que la(s) cánula(s) está/n precargada/s con el vector lentiviral a un volumen de entre 1 y 6 pl.