Virus cooperador obtenido a partir de adenovirus para mejorar la producción de parvovirus recombinantes.

Virus cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende:

(i) las siguientes secuencias de ADN adenovírico:

(a) un gen E2a;

(b) un gen E4 (orf6);

(c) un gen de ARN VAI; y

(ii) la secuencia de la unidad génica de la cápside VP de un parvovirus con replicación autónoma.

Virus cooperador obtenido a partir de adenovirus para mejorar la producción de parvovirus recombinantes La presente invención se refiere a un virus cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende las secuencias de ADN adenovírico de E2a, E4 (orf6) , el gen del ARN VAI y la unidad génica de la cápside VP de un parvovirus que se replica de forma autónoma. La presente invención también se refiere a un método para preparar de manera eficaz un parvovirus autónomo recombinante (partícula) que se basa en el uso de diversos virus/vectores cooperadores obtenidos a partir de adenovirus.

Los parvovirus son virus icosaédricos de ADN monocatenario. Su genoma contiene aproximadamente 5, 1 kilobases e incluye los promotores P4 y P38, que dirigen la expresión de proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y estructurales (VP1 y VP2) , respectivamente. Los parvovirus pertenecen a la familia Parvovirinae, junto con los Dependovirus y los Eritrovirus. Los Dependovirus incluyen los virus adenoasociados (VAA) . Estos virus, como su nombre indica, son dependientes de un virus cooperador, como el adenovirus, para un ciclo de infección productiva [1]. Por otro lado, los Eritrovirus y los Parvovirus son autónomos; son capaces de completar su ciclo productivo sin un virus cooperador. Los Eritrovirus incluyen B19, conocido por ser patógeno para los seres humanos.

Los parvovirus de roedores no son patógenos para los seres humanos y muestran propiedades oncotrópicas y oncolíticas que los vuelven agentes muy atractivos para la terapia contra el cáncer. Para mejorar aún más su capacidad antineoplásica intrínseca, se han generado virus recombinantes para entregar transgenes antitumorales a células cancerígenas. La estrategia consiste en sustituir los genes VP de la cápside por un transgén particular [2]. Los vectores conservan la secuencia que codifica NS1/2 (bajo el control del promotor P4 parvovírico) y los telómeros del genoma de parvovirus que son necesarios para la amplificación de ADN vírico y la encapsidación. El transgén de interés generalmente se expresa bajo el control del promotor P38, el cual se transactiva fuertemente con la proteína NS1. La producción de los virus recombinantes solo se puede producir en células productoras, proporcionando las proteínas VP en trans. La deleción de la región codificadora de la cápside en el genoma vírico ofrece la oportunidad de insertar transgenes de hasta aproximadamente 2500 nt, aunque grandes deleciones de VP reducen significativamente los títulos de producción, probablemente debido a la inhibición de elementos importantes de la encapsidación de virus que actúan en cis [2]. Los vectores de parvovirus recombinantes generados de esta manera tienen una replicación defectuosa, proporcionando una ventaja adicional para la seguridad terapéutica, en comparación con sus homólogos replicativos. Ejemplos de transgenes transducidos con éxito mediante parvovirus recombinantes, incluyen genes tóxicos, tales como la timidina cinasa del virus del herpes simple (por ejemplo, usada en combinación con el profármaco ganciclovir) [3] o apoptina [4]. Los viriones que expresan estos transgenes tienen actividades antineoplásicas mejoradas, en comparación con los virus de tipo silvestre. También se han generado parvovirus recombinantes que codifican genes inmunomoduladores tales como citocinas o quimiocinas, como interleucina-2 (IL-2) o proteína quimiotáctica de monocitos 1 o 3 (MCP-1) [5-8], proteína inducible con interferón-γ (IP-10) [9]. Estos viriones inducen un efecto espectador antitumoral potente en varios modelos de tumores in vitro e in vivo. Recientemente, se han observado efectos antitumorales sinérgicos usando una combinación de virus recombinantes que transducen el Factor de Necrosis Tumoral-α (TNF-α) e IP-10 [10].

El documento WO 01/25462 A1 se refiere a la producción de VAA recombinantes usando un adenovirus que comprende genes rep/cap de VAA.

El documento WO 03/061582 A2 se refiere a la generación de vectores de VAA a través de una metodología completamente mediada por adenovirus.

Las actividades cooperadoras del adenovirus frente a la replicación del VAA se han estudiado ampliamente. La proteína E1A adenovírica es esencial para la activación de la expresión génica de VAA mediante la unión y la activación del promotor P5 rep de VAA-2 [12]. Del mismo modo, E2A, otra proteína adenovírica, activa la transcripción del promotor P5 de VAA-2 [13]. E2A también parece que coopera con el ARN I asociado con virus (ARN VAI) para mejorar la traducción de los ARNs de VAA-2 [14]. E4 adenovírica (ORF6) mejora la conversión de los genomas de VAA-2 recombinantes de cadena sencilla, en genomas de doble cadena, una etapa limitante de la tasa de replicación del ADN vírico, tanto in vitro como in vivo [15]. El ARN VAI también puede impulsar la replicación de VAA-5. Se ha descrito que el ARN VAI interacciona físicamente con la proteína cinasa activada con ARN de doble cadena (PKR) , que de otro modo provocaría una respuesta inmune antivírica que bloquearía la producción de proteína vírica [16].

Estudios con VAA-2 recombinante han confirmado que un pequeño subconjunto de genes adenovíricos es suficiente para el efecto cooperador. En células HEK 293, que proporcionan el gen E1 en trans, el conjunto mínimo de genes para la producción eficaz de VAA-2 recombinante es E2a, E4 (orf6) y el gen del ARN VAI [17, 18]. Un plásmido cooperador denominado pXX6, que contiene este conjunto de genes, se utiliza actualmente para la producción de VAA-2 recombinante exento de adenovirus [18]. Este plásmido mantiene la producción de VAA-2 de una manera similar a la del adenovirus infeccioso [18, 19]. Los genes de adenovirus (E2a, E4ºrf6 y los genes del ARN VAI) también permiten la replicación del ADN del eritrovirus B19 humano y la producción vírica en células HEK 293, que de otro modo no serían permisivas para B19 [20].

Sin embargo, la interacción entre adenovirus y parvovirus autónomos se ha explorado menos. La replicación de par

vovirus H-1 en cultivos secundarios de células pulmonares embrionarias humanas normales no se inicia, a menos que se coinfecten con el adenovirus de serotipo 12 como virus cooperador [21]. Además, el adenovirus de serotipo 2 induce un aumento de la replicación del ADN de parvovirus MVMp y traslada el ADN de MVMp desde los nucleolos del hospedador a las plantas de replicación del adenovirus en células HeLa [22].

Un desafío principal en el desarrollo y la optimización de parvovirus recombinantes (rec.PVs) para aplicaciones clínicas, es incrementar la cantidad de virus que se produce. Debido a su naturaleza no proliferativa, su producción depende únicamente de la eficacia de la transfección de los componentes genómicos del parvovirus en las líneas celulares de encapsidación (células embrionarias de riñón humano normales, HEK 293 o 293T) . También el uso de líneas celulares de encapsidación que expresan constitutivamente las proteínas VP no mejoró significativamente la producción de parvovirus recombinantes [11]. Sigue siendo muy importante desarrollar medios para incrementar la producción de parvovirus recombinantes.

Por lo tanto, el problema en que se basa la presente invención es proporcionar un medio para incrementar la eficacia de la producción de parvovirus recombinantes.

Este problema técnico se resuelve proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Se ha encontrado, sorprendentemente, que también la producción de parvovirus recombinantes se puede beneficiar de la cooperación de genes de adenovirus. La producción de parvovirus recombinantes se realiza de forma clásica en células productoras HEK 293T, transfectándolas con el genoma de parvovirus recombinante y un plásmido que es portador de los genes VP de la cápside. El protocolo en uso produce títulos muy bajos de parvovirus recombinantes, en el intervalo de 0, 1 a 0, 5 unidades de transducción (TU) por célula productora, en las mejores condiciones. Además, debido a diferencias en la eficacia de la transfección del plásmido, también hay una alta variabilidad de los títulos obtenidos. Los virus generados de esta manera tienen una replicación defectuosa, pero contienen una pequeña fracción de virus competentes para la replicación (RCVs) reconstituidos a través de recombinaciones homólogas entre los genomas víricos y los genes de la cápside [11]. Estos RCVs son contaminantes no deseados de las reservas víricas finales y por lo tanto es importante limitar su aparición durante la producción de parvovirus recombinantes.

En los experimentos resultantes en la presente invención, la eficacia de la producción de parvovirus recombinantes podría incrementarse significativamente... [Seguir leyendo]

1. Virus cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende:

(i) las siguientes secuencias de ADN adenovírico:

(a) un gen E2a; 5 (b) un gen E4 (orf6) ;

(c) un gen de ARN VAI; y

(ii) la secuencia de la unidad génica de la cápside VP de un parvovirus con replicación autónoma.

2. El virus cooperador obtenido a partir de adenovirus según la reivindicación 1, en el que la expresión de la unidad génica de la cápside VP de parvovirus autónomo está bajo el control de un promotor CMV.

3. El virus cooperador obtenido a partir de adenovirus según la reivindicación 1 o 2, en el que el parvovirus autónomo se obtiene a partir de un virus H-1 o MVM (virus diminuto de ratón) .

4. El virus cooperador obtenido a partir de adenovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las secuencias de ADN adenovíricas se obtienen a partir de Ad5.

5. Un método de preparación de un parvovirus autónomo recombinante caracterizado porque

(i) las células de mamífero se infectan con (a) un parvovirus recombinante que carece de los genes VP1 y VP2, y (b) el virus cooperador obtenido a partir de adenovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y

(ii) el parvovirus autónomo recombinante que carece de los genes VP1 y VP2 se aísla a partir de las células de mamífero o del medio después de cultivar las células.

6. El método según la reivindicación 5, en el que las células de mamífero son células NBK.

7. El método según la reivindicación 5 o 6, en el que el parvovirus recombinante se obtiene a partir de virus H1 o MVM (virus diminuto de ratón) .

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que las secuencias de ADN adenovírico del virus/vector cooperador se obtienen a partir de Ad5.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que en el vector de parvovirus recombinante los genes VP1 y VP2 están sustituidos por un transgén.

10. El método según la reivindicación 9, en el que la expresión del transgén está bajo el control del promotor P38.

11. El método según la reivindicación 9 o 10, en el que el transgén es un gen que codifica una proteína marca30 dora.

12. El método según la reivindicación 9 o 10, en el que el transgén es un gen que codifica un polipéptido terapéutico o inmunógeno.

13. El método según la reivindicación 12, en el que la proteína terapéutica es un polipéptido citotóxico, una citocina y/o una quimiocina.

14. Una composición que comprende el virus/vector cooperador obtenido a partir de adenovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un parvovirus recombinante.

15. La composición según la reivindicación 14, en la que el virus cooperador obtenido a partir de adenovirus y el parvovirus recombinante contienen un transgén.

16. Una célula que contiene la composición según la reivindicación 15. 40

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7