Vectores de lentivirus pseudotipificados con una glucoproteína de envoltura de virus Sindbis.

Una partícula de vector lentivírico que comprende:

(a) una envoltura que comprende:

(i) una glucoproteína E2 de virus Sindbis de la SEC ID Nº: 1 en que 160X está ausente o es un aminoácido distinto de ácido glutámico o una variante de la SEC ID Nº: 1 del mismo que tiene al menos 80% de identidad para la SEC ID Nº: 1 y en que 160X está ausente o es un aminoácido distinto de ácido glutámico, capaz de infectar células dendríticas; en la que E2 no es parte de una proteína de fusión con virus Sindbis E3 y

(b) un genoma de vector lentivírico que comprende una o más secuencias de interés.

Vectores de lentivirus pseudotipificados con una glucoproteina de envoltura de virus Sindbis.

Campo tecnico Esta solicitud de patente se refiere en general a suministro de genes diana y mas en particular al uso de un lentivirus 5 pseudotipificado que comprende una envoltura que fija como objetivo celulas dendriticas y se puede usar asi para vacunacion con celulas dendriticas.

Antecedentes Las celulas dendriticas (las CD) son celulas presentadoras de antigenos esenciales para la iniciacion y control de respuestas inmunitarias. Las CD pueden capturar y procesar antigenos, migrar de la periferia a un organo linfoide y 10 presentar los antigenos para que queden celulas T en un modo restringido del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) . Estas celulas proceden de medula osea (MO) y muestran morfologia dendritica y alta movilidad. El descubrimiento de las CD como celulas presentadoras de antigeno especializadas (las CPA) ha impulsado intentos en estrategias de inmunizacion/vacunacion a base de CD que implican cargar las CD in vitro con antigenos especificos (Banchereau y Palucka, A. K. 2.005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, et al. 2.004. Nat.

Med. 10: 475-480) . Todos estos intentos, sin embargo, implican la trabajosa preparacion de un tratamiento especifico para el paciente que incluye la carga de las CD autologas ex vivo con antigenos especificos, que se administran despues al paciente.

Una estrategia alternativa es utilizar vectores a base de virus recombinantes como un mecanismo para suministrar directamente un gen que codifique un antigeno o antigenos designados a celulas huesped. En este caso, por 20 induccion de una respuesta inmunitaria de adaptacion deseada, el producto genico expresado proporciona beneficio terapeutico. Hay una serie de retos, sin embargo, para conseguir un sistema seguro y eficaz. Algunos de estos retos incluyen diserar un vector que fije como objetivo una serie deseada de celulas huesped, proporcionar un sistema de suministro adecuado, expresar un antigeno deseado para provocar una respuesta inmunitaria eficaz y consecuentemente fabricar una composicion farmaceutica con titulacion suficientemente alta del virus de vector de virus recombinante a fin de que pueda ser utilizado ampliamente por una poblacion de individuos humanos designada. Lo ultimo es un reto particular en el desarrollo de sistemas a escala laboratorio en productos que se pueden producir por la industria farmaceutica.

En el laboratorio, muchos vectores lentiviricos se pseudotipifican con las proteinas de envoltura VSV-G. Esto se usa extensamente como sistema modelo ya que las proteinas de envoltura VSV pueden fijar como objetivo muchos tipos 30 de celulas (una envoltura UpantropicaU) y los sistemas de produccion en general proporcionan un titulo alto.

Las glucoproteinas de envoltura de virus Sindbis y otros alfavirus desvelados en la presente memoria se incorporan a la bicapa lipidica de la membrana de la particula virica. Tipicamente, la membrana virica (envoltura) incluye multiples copias de trimeros de dos heterodimeros de glucoproteinas, E1 y E2, que se producen de escision de una sola proteina precursora. La proteina precursora comprende, desde su N- a C-terminal, las proteinas E3, E2, 6K y

E1. La pequera glucoproteina E3 sirve como secuencia seral para traslocacion de la proteina E2 en la membrana y se escinde de E2 por furina o alguna otra serina proteinasa dependiente de Ca2+. La proteina 6K sirve como secuencia seral para traslocacion de la proteina E1 en la membrana y se escinde despues de la proteina precursora.

Las glucoproteinas E1 y E2 tienen cada una regiones de expansion de membrana; E2 tiene un dominio citoplasmatico de aproximadamente 33 restos mientras la cola citoplasmatica de E1 es muy corta (aproximadamente 2 restos) . Tanto E1 como E2 tienen acidos palmiticos unidos a o cerca de las regiones de expansion de membrana.

Se cree que los aislados de virus Sindbis descritos en la tecnica infectan celulas via una interaccion con sulfato de heparan (SH) . En la patente internacional WO 2008/011636 se describio un sistema de empaquetamiento lentivirico en que la proteina de fusion de envoltura E3/E2 (denominada SVGmu) contiene una serie de modificaciones, 45 destinadas a reducir la union de la proteina a SH pero mantener la union a, e infeccion de, las CD, via la molecula superficial CD-SIGN. En la patente internacional WO 2008/011636, el ADNc para SVG de cepa natural se obtuvo del laboratorio del laboratorio del Dr. J. H. Strauss en el Instituto de Tecnologia de California y se clono en el vector pcDNA3 (Invitrogen) por PCR para generar plasmido pSVG. Se inserto una secuencia tag de diez restos en proteina E2 entre los aminoacidos 71 y 74 por mutagenesis PCR para romper el sitio de union de SH. Se introdujo una 50 supresion adicional en la glucoproteina E3 de SVG para retirar los aminoacidos 61-64. Este SVG modificado se designo como SVGmu (SEC ID N°:11 de la patente internacional WO 2008/011636) . El ADNc para SVGmu se clono aguas abajo del activador de CMV en el vector pcDNA3 (designado como pSVGmu, SEC ID N°: 3 de la patente internacional WO 2008/011636) .

Algunas realizaciones de la presente invención 55 Aunque las particulas viricas pseudotipificadas SVGmu podian transducir de manera selectiva celulas que expresan el antigeno CD-SIGN, varios aspectos del sistema lo hacen inadecuado para uso terapeutico. Por ejemplo, la

proteina de fusion E3/E2 muestra un epitopo antigenico de hemaglutinina de influenza, el genoma del virus se integra en el cromosoma huesped, que puede activar genes huesped perjudiciales y los presentes autores han encontrado que los titulos del virus fueron bajos comparados con el titulo de particulas pseudotipificadas con una envoltura de VSV-G. De manera significativa, las cepas de virus Sindbis con una mutacion que evita el correcto tratamiento de E3 de la glucoproteina E2 (denominada Umutantes pE2U) , tales como SVGmu, crecen de manera deficiente en estirpes celulares permitidas y son atenuadas seriamente en patogenicidad en raton.

Una alineacion de la proteina E3-E2 SVGmu usada en la patente internacional WO 2008/011636 para pseudotipificar un vector lentivirico contra tres variantes de proteina E ejemplares de la presente invencion se muestra en la Figura 1. La numeracion indicada en la Figura 1 es por referencia a la cepa HR de proteinas de envoltura de virus Sindbis. A menos que se indique de otro modo, la numeracion usada en la presente memoria es por referencia a esta cepa de virus Sindbis. Los presentes autores han modificado la proteina SVGmu para proporcionar un sistema de produccion lentivirica mejorado. Las particulas viricas de la invencion se producen en un titulo significativamente mayor que aquellos usando SVGmu y tambien estimulan una respuesta inmunitaria mas fuerte. Ademas, las particulas lentiviricas pseudotipificadas presentan titulo mejorado e infectividad mejorada al tiempo que se mantiene la selectividad para las CD.

En una realizacion, la invencion proporciona una particula de vector lentivirico que comprende: (a) una envoltura que comprende (i) una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico o una variante de la SEC ID N°: 1 del mismo con al menos 80% de identidad para la SEC ID N°: 1 y en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico, capaz de infectar celulas dendriticas; en la que E2 no es parte de una proteina de fusion con virus Sindbis E3 y (b) un genoma de vector lentivirico que comprende una o mas secuencias de interes.

La variante puede ser capaz de unirse a DC-SIGN. Preferiblemente, tambien presenta union reducida a sulfato de heparan comparado con una proteina de referencia de cepa HR. La proteina E2 de la cepa HR se muestra como SEC ID N°: 18.

Preferiblemente, 160X es uno de los aminoacidos pequeros o alifaticos, incluyendo glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina. En un aspecto, 160X esta ausente o es glicina, valina, leucina o isoleucina. En una realizacion, X es glicina.

Una variante de la SEC ID N°: 1 se define como que comprende una secuencia con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1 en que 160X es retenido y como se definio anteriormente. La variante puede tener una o mas de las lisinas y argininas en los restos 50 a 180 de expansion de la region suprimidas o sustituidas independientemente con un aminoacido no basico. En una realizacion, el aminoacido no basico es acido glutamico o acido aspartico.

En un aspecto, el resto X se selecciona de una supresion, glicina, valina, leucina o isoleucina y una o mas de las lisinas y argininas en los restos 50 a 180 de expansion de la region... [Seguir leyendo]

1. Una particula de vector lentivirico que comprende:

(a) una envoltura que comprende:

(i) una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico o una variante de la SEC ID N°: 1 del mismo que tiene al menos 80% de identidad para la SEC ID N°: 1 y en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico, capaz de infectar celulas dendriticas; en la que E2 no es parte de una proteina de fusion con virus Sindbis E3 y

(b) un genoma de vector lentivirico que comprende una o mas secuencias de interes.

2. La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1, en la que el 160X esta ausente o es glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina, tal como seleccionada de glicina, valina, leucina o isoleucina.

3. La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la variante de la glucoproteina E2 tiene al menos un aminoacido modificado para reducir su carga positiva neta.

4. La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 3, en la que al menos un aminoacido que se tiene que modificar para reducir la carga positiva neta se elige de: lisina 70, lisina 76 o lisina 159 de la SEC ID N°:1 y preferiblemente en la que las sustituciones se eligen independientemente de acido glutamico o acido aspartico.

5. La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1, en la que la secuencia de la variante de E2 son los restos de aminoacido 66 a 488 de la SEC ID N°: 3, los restos de aminoacido 66 a 488 de la SEC ID N°: 4 o los restos de aminoacido 66 a 486 de la SEC ID N°: 5 (variantes 1, 2 y 3) .

6. La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que es una variante en que la secuencia de los resto.

7. 75 de la SEC ID N°: 1 es igual o tiene una o dos sustituciones que no afectan a la capacidad de la variante para infectar las CD, pero no modifica el numero de aminoacidos en esta region.

7. La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de interes expresa un producto que es un antigeno de un agente causante de enfermedad o una celula enferma.

8. La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de interes codifica un antigeno especifico del tumor, opcionalmente NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, un antigeno de linaje de melanocito-melanoma, tal como gp100, gp75, mda-7, tirosinasa o proteina relacionada con tirosinasa; antigeno de carcinoma de celulas renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbonica I, anhidrasa carbonica IX (tambien conocida como G250) , factores inducibles por hipoxia (opcionalmente, HIF-1 alfa o HIF-2alfa) , VEGF o antigeno de membrana especifico de la prostata (PSMA) , antigeno especifico de la prostata (PSA) , fosfatos acidos prostaticos, antigeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata (STEAP) , NKX3.1, proteinas/peptidos de epitopos derivados de genes mutados en celulas tumorales o genes transcritos a diferentes niveles en el tumor comparado con celulas normales, tales como enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reorganizacion de bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado o de cepa natural, citocromo P450 1B1, secuencias de intrones expresadas anormalmente tales como N-acetilglucosaminiltransferasa-V; reordenaciones clonicas de genes de inmunoglobulina que generan idiotipos unicos en el mieloma o linfomas de celulas B; proteinas/peptidos de epitopos derivados de procedimientos oncoviricos, tales como proteinas del virus del papiloma humano E6 o E7 o proteinas oncofetales no mutadas con una expresion selectiva del tumor, tal como antigeno carcinoembrionico o alfa-fetoproteina.

9. La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en la que la secuencia de interes codifica un antigeno derivado de virus, tal como un antigeno de VIH o VIS, polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, por ej., un antigeno de la capside de calicivirus, polipeptidos de coronavirus, polipeptido de virus del distemper, polipeptido de virus de Ebola, polipeptido de enterovirus, polipeptido de flavivirus, polipeptido de virus de la hepatitis (AE) , por ej., un antigeno del nucleo o de superficie de la hepatitis B o una glucoproteina E1 o E2 del virus de la hepatitis C, proteinas de nucleo o no estructurales, polipeptido de herpesvirus, por ej., una glucoproteina de virus de herpes simple o de virus de varicela zoster, polipeptido de virus de inmunodeficiencia, por ej., la envoltura o proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptido de virus de peritonitis infecciosa, polipeptido de virus de la influenza, por ej., una hemaglutinina de la influenza A, neuraminidasa

o nucleoproteina, polipeptido de virus de la leucemia, polipeptido de virus de Marburg, polipeptido de ortomixovirus, polipeptido de virus de papiloma, polipeptido de virus de parainfluenza, por ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipeptido de paramixovirus, polipeptido de parvovirus, polipeptido de pestivirus, polipeptido de virus de picorna, por ej., un polipeptido de capside de poliovirus, polipeptido de pox virus, por ej., un polipeptido de virus vaccinia, polipeptido del virus rabies, por ej., una glucoproteina G del virus rabies, polipeptido de reovirus, polipeptido de retrovirus o polipeptido de rotavirus.

10. Una composicion que comprende una particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 9, en la que la composicion tiene una UI de al menos 105/ml.

11. Un sistema de empaquetamiento de vector lentivirico para producir una particula de vector lentivirico pseudotipificado segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, que comprende:

(i) una primera molecula de acido nucleico que codifica la glucoproteina E2 del virus Sindbis segun la reivindicacion 1 (a) (i) y

(ii) una segunda molecula de acido nucleico que codifica proteinas gag y pol,

(iii) una tercera molecula de acido nucleico que codifica rev;

(iv) un genoma de vector lentivirico que comprende una secuencia de interes y

(v) una celula de empaquetamiento.

12. El sistema de empaquetamiento de vector lentivirico segun la reivindicacion 11, en la que:

(a) la proteina pol presenta una integrasa no funcional y/o

(b) la proteina pol presenta una integrasa no funcional con una mutacion D64V y/o

(c) el genoma de vector lentivirico es un genoma lentivirico no integrante y/o

(d) la celula de empaquetamiento se transforma de manera estable con (ii) y (iii) y/o

(e) la celula de empaquetamiento se transinfecta con (i) y (iv) .

13. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la glucoproteina E2 o variante segun la reivindicacion 1 (a) (i) o una cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

14. La molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 13, en la que la proteina es una poliproteina E3/E2/6K/E1 de Sindbis que se trata de manera que la proteina E2 no sea parte de una proteina de fusion con E3 cuando se incorpora a una envoltura virica.

15. La molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 14, en la que la secuencia E3 corresponde a (a) restos 165 de la SEC ID N°: 20 o (b) una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia para los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20, en la que los resto.

6. 65 son RSKR (SEC ID N°: 27) y la variante es capaz de incorporarse a una envoltura virica pseudotipificada.

16. Un metodo para preparar una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, que comprende cultivar la celula de empaquetamiento segun la reivindicacion 11.

17. La particula lentivirica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, en la que el genoma del vector lentivirico:

(a) tiene una repeticion terminal larga 3' (LTR) inactivada o auto-inactivada y/o

(b) comprende un elemento U3 que carece de al menos uno de: (i) una secuencia potenciadora; (ii) una caja TATA

(iii) un sitio Sp1 (iv) un sitio NK-kappa B y (v) un tramo de polipurina (PPT) y/o

(c) comprende la secuencia de nucleotidos de la SEC ID N°: 21, 22 o 23 y/o

(d) comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un factor de maduracion/estimulacion de celulas dendriticas.

18. Una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, para uso en un metodo de tratamiento de un individuo, ser humano o animal, que comprende opcionalmente suministrar particulas de vector lentivirico a celulas dendriticas ex vivo.

19. Una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, para uso en la induccion de una respuesta inmunitaria especifica del antigeno, opcionalmente una respuesta humoral y/o respuesta celular.

20. Una vacuna terapeutica o profilactica que comprende las particulas de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

21. La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 20, que comprende ademas un adyuvante.

22. La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 21, en la que el adyuvante es un adyuvante de la

formula (I) :

(I)

en la que A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de: hidrogeno, fosfato y sales de fosfato y los restos 5 R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo con 3 a 23 carbonos, representados por C3-C23.

23. La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 22, en la que:

(a) A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrogeno y

(b) (i) R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20 y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20 o

(ii) R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 y R2 y R4 son hidrocarbilo C13 o (iii) R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.