Variante de lipasa.

Lipasa que es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que:

a) tiene al menos un 90 % de identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109;

b) en comparación con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitución de T231R; y

i) comprende un aminoácido negativo en la posición E210 de dicha lipasa tipo salvaje;

ii) comprende un aminoácido cargado negativamente en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje; y

iii) comprende un aminoácido neutro o negativo en una posición correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tiene una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa tipo salvaje

Variante de lipasa CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a variantes de lipasa adecuadas para uso en composiciones detergentes. Más particularmente, la invención se refiere a variantes de la lipasa tipo salvaje de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 que muestra un efecto de primer lavado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Durante varios años, las lipasas han sido usadas como enzimas de detergente para eliminar manchas de lípidos o grasas de ropa y otros tejidos, particularmente una lipasa derivada de Humicola lanuginosa (EP258068 y EP305216) vendida bajo el nombre comercial Lipolase® (producto de Novo Nordisk A/S).

[0003] WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202 revelan variantes de la lipasa de H. lanuginosa con propiedades mejoradas para uso detergente. Así, WO 97/04079 divulga variantes con una adición peptídica (extensión) en el N-terminal y/o el C-terminal. WO 97/07202 divulga variantes de lipasa con "rendimiento de primer lavado" que son capaces de eliminar cantidades sustanciales de manteca de cerdo de una muestra manchada de manteca de cerdo en un ciclo de lavado.

[0004] Hay siempre una necesidad existente de suministrar lipasas nuevas con propiedades de lavado en una variedad de detergentes comerciales. La presente invención se refiere a tales lipasas nuevas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] Los inventores han encontrado que determinadas variantes de Lipolasa (lipasa de tipo salvaje de Humicola lanuginosa) tienen un rendimiento de primer lavado particularmente bueno en una solución de detergente. Las lipasas pueden proporcionar además beneficios adicionales, tales como mantenimiento de blancura y limpieza de suciedad.

[0006] Los inventores encontraron que las variantes deberían comprender una o más sustituciones con aminoácidos positivos cerca del N-terminal en la estructura tridimensional. Las variantes deberían comprender además una adición peptídica al C-terminal y/o deberían encontrar ciertas limitaciones en aminoácidos eléctricamente cargados en posiciones 90-101 y 210.

[0007] Por consiguiente, la invención proporciona una lipasa que es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos

que:

(a) tiene al menos un 90% de identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109;

(b) en comparación con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitución de T231R; y

(i) comprende un aminoácido negativo en la posición E210 de dicha lipasa de tipo salvaje;

(¡i) comprende un aminoácido negativamente cargado en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje; y

(iii) comprende un aminoácido negativo o neutro en una posición correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tiene una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Lipasa Humicola lanuginosa

[0008] La lipasa de referencia usada en esta invención es la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109. Está descrito en los documentos EP258068 y EP305216 y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-269 de SEC ID n.°: 2 de US5869438. En esta especificación, la lipasa de referencia es también denominada Lipolasa.

Sustitución con aminoácido positivo

[0009] La lipasa de la invención comprende uno o más (p. ej. 2-4, particularmente dos) sustituciones de un aminoácido cargado negativamente o eléctricamente neutro cerca de E1 o Q249 con un aminoácido positivamente cargado, preferiblemente R.

[0010] La sustitución está en la superficie de la estructura tridimensional dentro de 15A de E1 o Q249, por ejemplo en

cualquiera de las posiciones 1-11, 90, 95, 169, 171-175, 192-211, 213-226, 228-258, 260-262.

[0011] La sustitución puede estar dentro de 10 A de E1 o Q249, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-7, 10, 175, 195, 197-202, 204-206, 209, 215, 219-224, 230-239, 242-254.

[0012] La sustitución puede estar dentro de 15Ade E1, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-11, 169, 171, 192- 199, 217-225, 228- 240, 243-247, 249, 261-262.

[0013] La sustitución está más preferiblemente dentro de 10A de E1, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-7, 10, 219-224 y 230-239.

[0014] Así, algunas sustituciones preferidas son S3R, S224R, P229R, T231 R, N233R, D234R y T244R.

Adición peptídica a C-terminal

[0015] La lipasa puede comprender una adición peptídica fijada a C-terminal L269. La adición peptídica mejora el rendimiento de primer lavado en una variedad de detergentes.

[0016] La adición peptídica preferiblemente consiste en 1-5 aminoácidos, por ejemplo 2, 3 o 4 aminoácidos. Los aminoácidos de la adición peptídica serán numerados 270, 271, etc.

[0017] La adición peptídica puede consistir en aminoácidos eléctricamente neutros (p. ej. hidrófobos), por ejemplo PGL o PG. En una forma de realización alternativa, la adición de péptido de lipasa consiste en aminoácidos neutros (p. ej. hidrófobos) y el aminoácido C, y la lipasa comprende sustitución de un aminoácido con C en una ubicación adecuada para formar un puente disulfuro con el C de la adición peptídica. Ejemplos son:

270C enlazado a G23C o T37C

271C enlazado a K24C, T37C, N26C o R81C

272C enlazado a D27C, T35C, E56C, T64C o R81C.

Aminoácidos en posiciones 90-101 y 210

[0018] La lipasa de la invención preferiblemente presenta ciertas limitaciones en aminoácidos eléctricamente cargados en posiciones 90-101 y 210. Las lipasas que presentan limitaciones de carga son particularmente eficaces en un detergente con alto contenido de aniónico.

[0019] Así, el aminoácido 210 puede ser negativo. E210 puede estar invariado o puede tener la sustitución E210D/C/Y, particularmente E210D.

[0020] La lipasa puede comprender un aminoácido cargado negativamente en cualquiera de las posiciones 90-101 (particularmente 94-101), por ejemplo en la posición D96 y/o E99.

[0021] Además, la lipasa puede comprender un aminoácido neutro o negativo en la posición N94, es decir N94 (neutro o negativo), por ejemplo N94N/D/E.

[0022] También, la lipasa puede tener una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región 90-101 (particularmente 94-101), es decir el número de aminoácidos negativos es igual o mayor al número de aminoácidos positivos. Así, la región puede estar invariada de la Lipolasa, que tiene dos aminoácidos negativos (D96 y E99) y uno positivo (K98), y un aminoácido neutro en la posición 94 (N94), o la región se puede modificar por una o más sustituciones.

[0023] Alternativamente, dos de los tres aminoácidos N94, N96 y E99 pueden tener una carga eléctrica negativa o invariada. Así, los tres aminoácidos pueden ser invariados o se pueden cambiar por una sustitución conservadora o negativa, es decir N94 (neutro o negativo), D (negativo) y E99 (negativo). Ejemplos son N94D/E y D96E. También, uno de los tres se puede sustituir para aumentar la carga eléctrica, es decir, N94 (positivo), D96 (neutro o positivo) o E99 (positivo o neutro). Ejemplos son N94K/R, 96I/L/N/S/W o E99N/Q/K/R/H.

[0024] La sustitución de un aminoácido neutro con uno negativo (N94D/E), puede mejorar el rendimiento en un detergente aniónico. La sustitución de un aminoácido neutro con un aminoácido positivo (N94K/R) puede proporcionar una lipasa variante con buen rendimiento tanto en un detergente aniónico como en un detergente aniónico/no iónico (un detergente con por ejemplo 40-70 % aniónico respecto al surfactante total).

Aminoácidos en otras posiciones

[0025] Los inventores han encontrado que una sustitución Q249R/K/H puede mejorar el rendimiento tanto en un detergente aniónico como en uno aniónico/no iónico, y que una sustitución de R209 con un aminoácido neutro o negativo (p. ej. R209P/S) puede mejorar el rendimiento en el detergente aniónico. La lipasa puede opcionalmente

comprender la sustitución G91A.

[0026] La lipasa puede opcionalmente comprender sustituciones de uno o más aminoácidos adicionales. Tales sustituciones pueden, por ejemplo, ser hechas según principios conocidos en la técnica, por ejemplo sustituciones

descritas en WO92/05249, W094/25577, W095/22615, W097/04079 y W097/07202.

Combinaciones de sustituciones

[0027] Una variante de lipasa con buen rendimiento de primer lavado se puede obtener modificando la Lipolasa de la 10 siguiente manera. Las sustituciones entre paréntesis son opcionales.

T231R+ N233R______________________________________________________________________

1. Lipasa que es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que:

a) tiene al menos un 90 % de identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109;

b) en comparación con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitución de T231R; y

i) comprende un aminoácido negativo en la posición E210 de dicha lipasa tipo salvaje;

ii) comprende un aminoácido cargado negativamente en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje; y

iii) comprende un aminoácido neutro o negativo en una posición correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tiene una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa tipo salvaje.

2. Lipasa según la reivindicación 1 que comprende una sustitución de un aminoácido aminoácido cargado negativamente o eléctricamente neutro en cualquiera de las posiciones 1-7, 10, 219-224 y 230-239 con R.

3. Lipasa según la reivindicación 1 o 2 que comprende una sustitución de aminoácido S3, S224, P229, N233, D234 o T244 con un aminoácido cargado positivamente, preferiblemente R.

4. Lipasa según cualquier reivindicación precedente que comprende una adición peptidica en el C-terminal.

5. Lipasa según la reivindicación 4 donde la adición peptidica consiste en 1-5 aminoácidos.

6. Lipasa según la reivindicación 4 o 5 donde la adición peptidica consiste en aminoácidos eléctricamente neutros (preferiblemente hidrófobos), y es preferiblemente PGL o PG.

7. Lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 4-6 donde la adición peptidica consiste en aminoácidos neutros (preferiblemente hidrófobos) y C, y la lipasa además comprende la sustitución de un aminoácido con C para formar un puente disulfuro con el C de la adición peptidica.

8. Lipasa según cualquier reivindicación precedente que comprende aminoácidos con carga eléctrica invariada o negativa en al menos dos de las posiciones N94, D96 y E99 de dicha lipasa tipo salvaje.

9. Lipasa de cualquier reivindicación precedente que comprende una sustitución G91A, N94D/E/K/R, D96E/I/L/N/S/W, E99N/Q/K/R/H, N101S, R209P/S o Q249R/K/H.

10. Lipasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende uno de los siguientes grupos de sustituciones, opcionalmente combinadas con Q249R/K/H y/o K98X:

a) G91 G/A/S/T + N94 (neutro o negativo) + D96D/E/C/Y + E99E/D/C/Y,

b) G91 G/A/S/T + N94 (neutro o negativo) + D96D/E/C/Y + E99N + N101 S,

c) G91 G/A/S/T + N94R/K/H + D96D/E/C/Y + E99E/D/C/Y,

d) G91 G/A/S/T + N94 (neutro o negativo) + D96 (neutro o positivo) + E99E/D/C/Y, o

e) G91 G/A/S/T + N94 (neutro o negativo) + D96D/E/C/Y + E99 (neutro o positivo).

11. Lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende una de los siguientes grupos de sustituciones, opcionalmente combinados con R209 (neutro o negativo):

a) E99R/K/H + Q249R/K/H,

b) N94R/K/H + Q249R/K/H, o

c) D96 (neutro o positivo) + Q249R/K/H.

12. Lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que comprende uno de los siguientes grupos de sustituciones:

a) G91A+ E99K + T231 R+N233R + Q249R;

b) E99N +N101S +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

c) N33Q +E99N +N101S +T231R +N233R +Q249R +270PGL;

d) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

e) N33Q +G91A +E99K +T231R + N233R + Q249R + 270PGL;

f) E1A +G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

g) E1A +N33Q +G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

h) G91A + E99K +G255R +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

i) N33Q +G91A +E99K +G255R +T231 R +N233R +Q249R +270PGL;

j) G91A + E99K + T231 R +N233R +T244R +Q249R +270PGL;

k) N33Q +G91A +E99K +T231 R +N233R +T244R +Q249R +270PGL;

l) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R;

m) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270AGVF;

n) G91A +E99K +T189G +T231 R +N233R +Q249R;

o) E1A +N33Q +G91A +E99K +T231R +N233R +Q249R +270PGLPFKRV;

p) N33Q +S83T +E87K +G91A + E99K +T231 R +N233R +Q249R +270PGLPFKRV;

q) N33Q +G91A + E99K +T231 R +N233R +Q249R +270PGLPFKRV;

r) N33Q +E99N +N101 S +T231 R +N233R +Q249R +270PGLPFKRV;

s) D62A +S83T + G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R;

t) E99N +N101S +T231 R +N233R +Q249R;

u) R84W +G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R;

v) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270SPG;

w) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270VVVP;

x) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270LLASSGRGGHR;

y) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270VTT;

z) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270VLQ; aa) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270TST; bb) G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R +270LRI;

cc) V60G +D62E +G91A +E99K +T231 R +N233R +Q249R;

dd) G91A +D96W +E99K +T231 R +N233R +G263Q +L264A +I265T +G266S +T267A +L269N +270AGGFS; ee) G91A +D96W +E99K +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N

+270AGGFSWRRYRSAESVDKATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQAR S.

13. Composición de detergente que comprende un surfactante y la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Composición de detergente de la reivindicación precedente donde el surfactante comprende surfactante aniónico en una cantidad superior a 70 % en peso del surfactante total

15. Composición de detergente de la reivindicación 13, donde el surfactante comprende surfactante aniónico en una cantidad de 40-70 % en peso y surfactante no iónico en una cantidad de 30-60 % en peso del surfactante total, y la lipasa es la lipasa de la reivindicación 6 o 7.

16. Composición de detergente de cualquiera de las reivindicaciones 13-15 que comprende 10-40 % en peso de surfactante, preferiblemente comprende 40-70 % de constructor, y preferiblemente tiene un pH de 9-11 cuando se disuelve en agua a 0,5-5 g/l.

17. Secuencia ADN que codifica la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

18. Vector de expresión que contiene la secuencia de ADN de la reivindicación precedente.

19. Célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN según la reivindicación 17 o el vector de expresión según la reivindicación 18.

20. Método para producir la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el cual comprende el cultivo de la célula huésped transformada según la reivindicación 19 bajo condiciones que permitan la producción de la lipasa y la recuperación de la lipasa del caldo resultante.