Vacunas para la prevención y tratamiento de infección por VIH.

Una composición que comprende:

a) un polipéptido que comprende p17 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma,

p51 RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma y p24 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en los que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y p24 Gag; y

b) una proteína env de VIH o fragmento inmunogénico o derivado de la misma,

en la que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.

Vacunas para la prevención y tratamiento de infección por VIH

Campo de la invención La presente invención se refiere a construcciones de polipéptidos de VIH novedosas, y a composiciones farmacéuticas que las comprenden. Se describe también procedimientos para su fabricación y su uso en medicina. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. En particular, se describen en la presente invención proteínas de fusión que comprenden Nef de VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de los mismos, y a polinucleótidos que los codifican. De forma más particular, se describen proteínas de fusión que comprenden proteínas Nef de VIH-1, Pol de VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de los mismos y polinucleótidos que los codifican.

El VIH-1 es la causa primaria del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que está catalogado como uno de los principales problemas de salud en el mundo. Hay una necesidad de una vacuna para la prevención y/o tratamiento de la infección por VIH.

Antecedente de la invención El VIH-1 es un virus de ARN de la familia de los retrovirales. El genoma del VIH codifica al menos nueve proteínas que se dividen en tres clases: las proteínas estructurales principales Gag, Pol y Env, las proteínas regulatorias Tat y Rev, y las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. El genoma del VIH muestra la organización 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de todos los restrovirus.

La glicoproteína gp120 de envoltura del VIH es la proteína viral que se usa para la adhesión a la célula huésped. Esta adhesión está mediada por la unión de dos moléculas de superficie de las células T de ayuda y macrófagos, conocidos como CD4 y uno de los dos receptores de la quemoquina CCR-5 o CXCR-4. La proteína gp120 se expresa en primer lugar como una molécula precursoras mayor (gp160) , que luego se escinde posttranslacionalmente para dar gp120 y gp41. La proteína gp120 está retenida sobre la superficie del virón mediante conexión a la molécula gp41, que está insertada en la membrana viral.

La proteína gp120 es la diana principal de los anticuerpos de neutralización, pero desafortunadamente la mayoría de las regiones inmunogénicas de las proteínas (bucle V3) son también las partes más variables de la proteína. Por tanto, se cree que el uso de gp120 (o su precursor gp160) como un antígeno para vacuna para educir anticuerpos de neutralización va a ser de uso limitado para una vacuna ampliamente protectora. La proteína gp120 también contiene epítopos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL) . Estas células efectoras son capaces de eliminar las células infectadas con virus, y por tanto constituyen un segundo mecanismo inmunológico antiviral principal. Al contrario que las regiones diana de anticuerpos de neutralización algunos epítopos de CTL parecen ser conservados relativamente entre diferentes cepas de VIH. Por esta razón gp120 y gp160 pueden ser componentes antigénicos útiles en vacunas que ayudan a educir respuestas inmunes mediadas por células (particularmente CTL) .

Proteínas de no envoltura de VIH-1 incluyen, por ejemplo, proteínas estructurales internas tales como los productos de genes gag y pol y otras proteínas no estructurales tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Green y col., New England J. Med, 324, 5, 308 y siguientes (1991) y Br y ant y col. (Ed. Pizzo) , Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y siguientes (1992) .

La Nef del VIH es una proteína temprana, esto es, es expresada pronto en infección y en ausencia de proteína estructural.

El gen de Nef codifica pronto una proteína del VIH accesoria que ha demostrado poseer varias actividades. Por ejemplo, se sabe que la proteína Nef provoca la baja regulación de CD4, receptor del VIH, y moléculas de clase I MHC de la superficie celular, aunque está en debate la importancia biológica de estas funciones. De forma adicional, Nef interactúa con la ruta de señal de las células T e induce un estado activo, que en cambio puede promover expresión génica más eficiente. Algunos aislados del VIH presentan mutaciones en esta región, lo que hace que no codifiquen proteína funcional y se vean seriamente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo.

El gen de Gag se translada como una poliproteína precursora que se escinde mediante proteasa para dar productos que incluyen la proteína matriz (p17) , la cápsida (p24) , la nucleocápsida (p9) , p6 y dos péptidos espaciales, p2 y p1.

El gen Gag da lugar a la proteína precursora Gag de 55 kilodalton (kD) , también denominada p55, que se expresa a partir del ARNm viral no empalmado. Durante la translación el término N de p55 es miristoilado, activando su asociación con el aspecto citoplasmático de las membranas celulares. La poliproteína Gag asociada a la membrana recluta dos copias del ARN genómico viral con otras proteínas virales y celulares que activa la germinación de la partícula viral desde la superficie de una célula infectada. Tras la germinación se esciende la p55 mediante la proteasa codificada viralmente (un producto del gen de pol) durante el proceso de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas designadas MA (matriz [p17]) , CA (cápsida [p24]) , NC (nucleocápsida [p9]) , y p6.

Además de las 3 proteínas Gag principales, todos los precursores de Gag contienen otras regiones distintas, que se escinden y permanecen en el virión como péptidos de varios tamaños. Estas proteínas tienen diferentes papeles, por ejemplo, la proteína p2 tiene un papel propuesto en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la cronología correcta del procesamiento proteolítico.

El polipéptido p17 (MA) se deriva del extremo miristoilado, de terminal N de la p55. La mayoría de las moléculas de MA permanecen adheridas a la superficie interna de la bicapa lípida del virión, estabilizando la partícula. Se recluta un subconjunto de MA dentro de las capas más profundas del virión, donde comienza a formar parte del complejo

que acompaña al ADN viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral debido a que es reconocida una señal cariofílica en MA por parte de la maquinaria de importación nuclear celular. Este fenómeno permite al VIH infectar las células que no se dividen, una propiedad inusual para un retrovirus.

La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de las partículas virales. Se ha demostrado que la ciclofilina A interactúa con la región p24 de la p55 llevando a su incorporación a las partículas de VIH. La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial debido a que la disrupción de esta interacción por parte de la ciclosporina A inhibe la replicación viral.

La región NC de Gag es responsable del reconocimiento específico de la denominada señal de empaquetamiento del VIH. La señal de empaquetamiento consiste en cuatro estructuras tallo-bucle localizadas cerca del extremo 5’ del ARN viral, y es suficiente para mediar la incorporación de un ARN heterólogo en los viriones de VIH-1. La NC se une a la señal de empaquetamiento a través de interacciones mediadas por dos motivos dedo de cinc. La NC también facilita la transcripción inversa.

La región polipeptídica p6 media las interacciones entre p55 Gag y la proteína accesoria Vpr, llevando a la incorporación de Vpr en viriones de ensamblado. La región p6 también contiene un denominado dominio tardío que se requiere para la liberación eficiente de viriones de germinación desde una célula infectada.

El gen de Pol codifica dos proteínas que contienen las dos actividades necesitadas por el virus en la infección precoz, la RT y la proteína integrasa necesarias para la integración del ADN viral en el ADN de la célula. El producto primario de Pol se escinde mediante la proteasa del virión para dar el péptido RT de terminal amino que contiene necesariamente actividades para la síntesis de ADN (actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y ADN así como también una función de ARNasa H) y proteína integrasa de terminal carboxi. La RT del VIH es un heterodímero de RT (p66) de longitud completa y un producto de escisión (p51) al que le falta el dominio de ARNasa H de terminal carboxi.

RT es una de las proteínas más altamente conservadas codificada por el genoma retroviral. Dos actividades principales de RT son la ADN Pol y la ribonucleasa H. La actividad de ADN Pol de RT usa ARN y ADN como templados de forma intercambiable y como todas las ADN polimerasas conocidas es incapaz de iniciar la síntesis de ADN de nuevo, pero requiere una molécula pre-existente para servir como un cebador (ARN) .

La actividad de la ARNasa H inherente en todas las proteínas RT juega el papel esencial, ya en... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

a) un polipéptido que comprende p17 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, p51 RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma y p24 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en los que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y p24 Gag; y

b) una proteína env de VIH o fragmento inmunogénico o derivado de la misma,

en la que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína env de VIH es gp120. .

3. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el p51 RT comprende una mutación en la posición 592 para reemplazar la metionina por otro residuo, por ejemplo, lisina.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la Nef es Nef de longitud completa.

5. Una composición que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican:

a) un polipéptido que comprende p17 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, p51 RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma y p24 Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en los que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y p24 Gag; y

b) una proteína env de VIH o fragmento inmunogénico o derivado de la misma.

en la que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.

6. Una composición farmacéutica que comprende una composición de acuerdo con cualquier reivindicación previa, junto con un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el adyuvante es un adyuvante que induce Th1 tal como QS21 .

3. MPL o una combinación de QS21 .

3. MPL.

Figura 1A

SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras (F4 p24-RT-Nef-p17)

Figura 1B

Ensayo de solubilidad (F4 p24-RT-Nef-p17) Geles reductores (SDS-PAGE al 10%)

Figura 2: gel tintado con Coomasie y transferencia western para F4 optimizado con codón Figura 3

Asignación de proteínas RT: construcción GSK, HXB2, BH10

K: mutación puntual introducida para eliminar actividad del enzima Negrita y subrayado: aminoácidos que difieren de RT/HXB2 Bloque resaltado: dominio de RNasa H Negrita: primeros aminoácidos de integrasa Paréntesis: final de p51

Figura 4

Gel tintado con Coomasie y Transferencia western para P51 RT (optimizado con codón)

Figura 5:

Ensayo de solubilidad RT/P51 y RT/p66

Figura 6 Figura 7

Figura 8

Inducción: 19 horas, 22º C

Figura 9

Condición de inducción; 3 h, 30º C

Figura 10 Figura 11

Figura 12

Inducción: 19 horas, 22º C

Figura 13

Figura 13: purificación de F4

A: Gel SDS al 4-20% tintado con azul Coomasie, 5 μg de proteína/carril; B: transferencia western de anti-p24/anti Nef-Tat, 0, 5 μg de proteína/carril 1; patrón MW; carril 2, homogeneizado; carril 3, homogeneizado clarificado; carril 4, precipitado en AS resuspendido; carril 5, eluido en SO3; carril 6, eluido en octil sepharosa; carril 7, eluido en Q sepharosa; carril 8, eluido en Superdex 200.

Figura 14

Figura 14: purificación de F4 (p51) *

A: Gel SDS al 4-20% tintado con azul Coomasie, 5 μg de proteína/carril; B: transferencia western de anti-p24/anti Nef-Tat, 0, 5 μg de proteína/carril. Carril 1, homogeneizado F4; carril 2, homogeneizado F4 (51) *; carril 3, homogeneizado clarificado; carril 4, agregado de homogeneizado; carril 5, sobrenadante de precipitación en AS; carril 6, precipitado en AS resuspendido; carril 7, eluido en SO3; carril 8, eluido en octil sepharosa; carril 9, eluido en Q sepharosa; carril 10, eluido en Superdex 200; carril 11, eluido de F4 en Q; carril 12, eluido de F4 en Superdex 200.

Figura 15

Figura 15: purificación de F4*.

A: Gel SDS al 4-20% tintado con azul Coomasie, 5 μg de proteína/carril; B: transferencia western de anti-p24/anti Nef-Tat, 0, 5 μg de proteína/carril 1. Carril 1, homogeneizado; 2, homogeneizado clarificado; 3, precipitado en AS resuspendido; 4, eluido en SO3; 5, eluido en octil sepharosa; 6, eluido en Q; 7, eluido en Q sepharosa concentrado/dializado; 8, eluido en Superdex 200; 9, fracción rechazada de eluido en Superdex 200.

Figura 16

Eluido en Q Eluido en S200

Figura 16: pureza de F4 vs F4* vs F4 (51) *

A: eluido en Q, B: eluido en S200. Se cargaron los geles de SDS de 4-20% con 5 μg de proteína para el tinte azul Coomasie (en la izquierda) y con 0, 5 μg para la transferencia western anti-p24/anti-Nef-Tat (en la derecha) .

Figura 17

Figura 17: SDS-PAGE seguido de la purificación de F4co y F4co carboxiamidado. Se separaron 5 μg de cada fracción recogida durante la purificación de F4co o F4coca en un gel SDS al 4-12%. Se tiñó el gel con azul Coomasie. 1: homogeneizado; 2: eluido en CM hyperZ; 3: eluido en Q sepharosa; 4: volumen purificado.

Figura 18

Figura 18: análisis por SDS-PAGE de F4, F4co y F4coca purificados de acuerdo con el procedimiento de purificación I o procedimiento de purificación II. Se separaron 5 μg de cada proteína en un gel SDS al 4-12% en condiciones reductoras (izquierda) o en condiciones no reductoras (derecha) . Se tiñó el gel con azul Coomasie. 1: procedimiento II – F4co; 2: procedimiento II – F4coca; 3: procedimiento I – F4coca; 4: procedimiento I – F4; 5: procedimiento I – F4 carboxiaminado.

Figura 19 Figura 20