Usos médicos adicionales de la proteína antisecretora.

Una proteína antisecretora, un homólogo y/o un fragmento de la misma,

que tenga una actividad equivalente, y/o una sal farmacéuticamente activa de la misma, para uso en el tratamiento y/o la prevención de una afección asociada a la disfunción de balsas lipídicas y/o caveolas en membranas celulares, donde dicha afección se selecciona del grupo que consiste en disfunción vascular, disfunción cardiovascular, disfunción pulmonar, diabetes mellitus, complicaciones relacionadas con diabetes mellitus, hiperplasia y/o hipertrofia de células y/o tejido, cardiomiopatía, trastorno pulmonar y tumores y complicaciones de los mismos, o para uso terapéutico para facilitar una mejor biointegración de material extraño implantado en un mamífero.

Usos mïdicos adicionales de la proteïna antisecretora Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere al uso de proteïnas antisecretoras, sus homïlogos y/o fragmentos, que presenten una actividad funcional equivalente, y/o una sal farmacïuticamente activa de las mismas, para la fabricaciïn de una composiciïn farmacïutica para el tratamiento y/o la prevenciïn de una afecciïn asociada a la disfunciïn de balsas lipïdicas y/o caveolas en las membranas celulares, tal como se define en la reivindicaciïn 10. La composiciïn farmacïutica se usa en la presente memoria para monitorizar y/o afectar de forma beneficiosa a la estructura, a la distribuciïn y a mïltiples funciones de las balsas lipïdicas, receptores y/o caveolas de las membranas. Los ejemplos de dichos efectos beneficiosos pueden contrarrestar la funciïn anormal, tal como una hipo- o hiper-funciïn, para restaurar y/o normalizar las balsas lipïdicas, receptores y/o caveolas estructural y funcionalmente, para mejorar la supervivencia y/o el rescate en enfermedades, lesiones, procesos de reparaciïn y otras disfunciones. Adicionalmente, tambiïn se describe el uso de dicha composiciïn farmacïutica para monitorizar el transporte intracelular y la liberaciïn de productos celulares, asï como para normalizar la distribuciïn de los constituyentes tisulares.

Antecedentes de la invenciïn Las balsas lipïdicas son microdominios dinïmicos y heterogïneos que forman regiones especializadas en las membranas celulares, y que estïn enriquecidos en colesterol y glicolïpidos, de forma mïs evidente esfingolipidos tales como GMi (Ross y Pawlina, 2006; Pollard y Earnshaw, 2002) . Una definiciïn suya in vitro es lo fracciïn insoluble que queda tras extraer con el detergente Triton X-100, usado diluido y en frïo. Dicha fracciïn de membrana resistente al detergente es recuperada como una banda de baja densidad aislada mediante gradientes de flotaciïn. La prevalencia de las balsas lipïdicas se reduce mediante agotamiento o desorganizaciïn de colesterol en las membranas celulares. Las balsas lipïdicas guardan una estrecha relaciïn y estïn conectadas con el citoesqueleto, y estïn implicadas en la polarizaciïn celular. Constituyen microdominios especializados, prevalentes en membranas de cïlulas y tejidos en todas las edades, p.ej., en embriones, fetos, asï como en individuos jïvenes, adultos y mayores.

Proteïnas de importancia clave en la cohesiïn y la transducciïn de seïal estïn enriquecidas en balsas lipïdicas, tal como los receptores, las proteïnas de uniïn celular, los transportadores iïnicos y los complejos de canal iïnico, que incluyen, p.ej., acuaporinas, asï como receptores de quimioquina, receptores de neurotransmisores, receptores hormonales y receptores de factor de crecimiento. Estas proteïnas y complejos proteïnicos estïn interactuando con los sistemas de proteïna G intracelular, que transfieren el mensaje recibido por, p.ej., los receptores al citoplasma y al nïcleo de la cïlula (Dermine et al., 2001; Ross y Pawlina, 2006; Pollard y Earnshaw, 2002; Helms y Zurzolo, 2004; Chini y Parenti, 2004; Head et al., 2006; Mahmutefendic et al., 2007) . Se ha demostrado que la distribuciïn y las concentraciones del ion clave en la monitorizaciïn de la actividad celular, Ca2+, estïn ïntimamente relacionadas con las balsas lipïdicas y las caveolas. Otras proteïnas adicionales, como las conexinas, CD38, CD19, Thy-1 y CD59, estïn ancladas a las balsas lipïdicas, normalmente a travïs de proteïnas y receptores anclados a glicosilfosfatidilinositol (GPI) , lo que les permite interaccionar con las funciones celulares. Los esfingolipidos, como se ilustra por el gangliïsido GMi, la diana de la toxina del cïlera, estïn enriquecidos y caracterizan a las balsas lipïdicas. Adicionalmente, los receptores de neurotransmisor y otros constituyentes de las sinapsis y los procesos neuronales, asï como receptores de factor de crecimiento, se encuentran dentro del amplio rango de proteïnas prevalentes en las balsas lipïdicas, p.ej., en cïlulas altamente especializadas como las neuronas. Los canales y los transportadores de ion calcio, de importancia clave en la regulaciïn de las funciones y las interacciones celulares, se encuentran confinados en un grado elevado a las balsas lipïdicas (A Spït, 2007) . Esto se puede ilustrar mediante la observaciïn de que la disrupciïn de las balsas lipïdicas dificulta o incluso previene la capacidad de la cïlula para propagarse viajando a travïs de ondas de Ca2+ en las cïlulas. Ademïs, las rïfagas de ion calcio influyen significativamente en funciones clave de las cïlulas normales y de cïlulas alteradas patolïgicamente, p.ej. la divisiïn celular, la supervivencia celular y la muerte celular.

Ademïs, se considera que las balsas lipïdicas desempeïan un papel fundamental en el trïfico intracelular de proteïnas, y la dinïmica de receptor y lïpidos. Los mensajes y las acciones de todas estas proteïnas receptoras y transportadoras se transmiten al interior de las cïlulas a travïs de sistemas de proteïnas G unidas, a travïs de sistemas enzimïticos o con la ayuda del citoesqueleto (Triantafilou y Triantafilou, 2004) . Se sabe que el estado fïsico de las balsas lipïdicas, p.ej., es conducente a concentrar y constreïir la movilidad de proteïnas mïltiples para facilitar el montaje dinïmico de complejos de seïalizaciïn competentes.

Lo que es mïs, se considera que las balsas lipïdicas tienen la capacidad de regular la activaciïn, la seïalizaciïn y la disposiciïn del citoesqueleto, lo que las hace crïticamente importantes para los mecanismos que gobiernan la locomociïn celular, que incluye la migraciïn direccional, asï como para mantener la forma y tamaïo de las cïlulas y el transporte asociado. Ademïs, el citoesqueleto es de importancia clave para el trïfico intracelular de los constituyentes celulares y como sensor de la carga dinïmica y estïtica sobre las cïlulas.

Las balsas lipïdicas son, por tanto, estructuras dinïmicas, normalmente con un diïmetro del orden de 5 – 50 nm, con un rango considerable de variaciïn. Existen multitud de estrategias para demostrar la presencia de balsas lipïdicas, p.ej., mediante demostraciïn inmunohistoquïmica e inmunoquïmica de GMi que tiene una afinidad muy elevada por la toxina del cïlera. Otro modo de demostrar su presencia y posiciïn es aislar membranas celulares tras haber roto 5 las cïlulas y despuïs aislar una fracciïn resistente a detergente a una temperatura definida, tal como se describe en los libros de texto de biologïa celular disponibles habitualmente. La flotilina, la cavolina y la reggie pueden usarse para identificar inmunohistoquïmicamente balsas lipïdicas. De esas proteïnas, la flotilina puede asociarse ademïs a gotïculas de lïpidos. La microscopïa de fuerza atïmica y otras estrategias relacionadas se aïaden a las tïcnicas que permiten la visualizaciïn de balsas lipïdicas. La exposiciïn de cïlulas a ciclodextrina y sus variantes, que provoca un agotamiento de colesterol en las membranas, constituye un modo alternativo de demostrar la prevalencia de las balsas lipïdicas.

Las caveolas constituyen un tipo especializado de balsas lipïdicas, que son estructuras dinïmicas que se caracterizan por el enriquecimiento focal en membranas de colesterol y esfingolipidos, que transducen seïales entre el entorno y el interior de las cïlulas, asï como que conectan al citoesqueleto. Al contrario que otras balsas lipïdicas,

las caveolas son mïs grandes y normalmente aparecen como grietas o invaginaciones con forma de matraz en las membranas celulares y como vesïculas (Kurzhalia y Parton, 1999) . Su tamaïo normalmente estï en el orden de 0, 1 μm, pero con variaciones considerables. Las caveolas son prevalentes, p.ej., en cïlulas musculares cardiacas y lisas, cïlulas endoteliales, macrïfagos y adipocitos, es decir, virtualmente en todas las cïlulas de mamïfero, aunque con una frecuencia altamente variable.

Se ha descrito que las balsas lipïdicas y las caveolas albergan e influyen en el sistema de generaciïn de NO (monïxido de nitrïgeno) . Ademïs de las seïales de transporte desde y hacia una cïlula, las caveolas estïn implicadas en el trïfico de fluidos y de varios compuestos desde y hacia una cïlula, la endocitosis y la regulaciïn, el trïfico, el eflujo y el mantenimiento de ïcidos grasos y colesterol en cïlulas y su entorno (Pohl et al., 2004; Rajendran et al., 2007) . Los constituyentes de caveolas y las balsas lipïdicas estïn implicadas adicionalmente en el

procesamiento de proteïna precursora amiloide β (βAPP) y amiloide β (Aβ) , proteïnas relacionadas preferentemente a enfermedades de Alzheimer pero tambiïn a otros trastornos neurodegenerativos y... [Seguir leyendo]

1. Una proteïna antisecretora, un homïlogo y/o un fragmento de la misma, que tenga una actividad equivalente, y/o una sal farmacïuticamente activa de la misma, para uso en el tratamiento y/o la prevenciïn de una afecciïn asociada a la disfunciïn de balsas lipïdicas y/o caveolas en membranas celulares, donde dicha afecciïn se selecciona del grupo que consiste en disfunciïn vascular, disfunciïn cardiovascular, disfunciïn pulmonar, diabetes mellitus, complicaciones relacionadas con diabetes mellitus, hiperplasia y/o hipertrofia de cïlulas y/o tejido, cardiomiopatïa, trastorno pulmonar y tumores y complicaciones de los mismos, o para uso terapïutico para facilitar una mejor biointegraciïn de material extraïo implantado en un mamïfero.

2. Una proteïna antisecretora para uso segïn la reivindicaciïn 1, donde dicha disfunciïn se selecciona del grupo que 10 consiste en funciïn anormal, funciïn insuficiente, hipofunciïn e hiperfunciïn.

3. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna antisecretora consiste en una secuencia segïn la siguiente fïrmula X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,

donde X1 es I, los aminoïcidos 1-35 de la SEQ ID NO 6, o estï ausente, X2 es H, R ï K, X3 es S ï L, X4 es T ï A, 15 X5 es los aminoïcido.

4. 46.

4. 51.

4. 80 ï.

4. 163 de la SEQ ID NO 6, o estï ausente.

4. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica que comprende dos o mïs proteïnas antisecretoras.

5. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna

antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica que comprende un excipiente farmacïuticamente aceptable.

6. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica que se formula para administraciïn intraocular, intranasal, oral, local, subcutïnea y/o sistïmica.

7. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica que se formula para administraciïn como un espray, aerosol, inhalador o mediante un nebulizador.

8. Una proteïna antisecretora para uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicha proteïna antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica que se formula para administraciïn sistïmicamente en sangre con una dosis de aplicaciïn de 0, 1 μg a 10 mg por kg de peso corporal y dïa, preferiblemente 1-1000 μg por kg de peso corporal y dïa.

9. Una proteïna antisecretora para uso segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha proteïna antisecretora debe administrarse en una composiciïn farmacïutica cuya administraciïn debe realizarse en una dosis individual o como mïltiples aplicaciones diarias.

10. El uso de una proteïna antisecretora, un homïlogo y/o un fragmento de la misma, que tenga una actividad equivalente, y/o una sal farmacïuticamente activa de la misma, para la fabricaciïn de una composiciïn farmacïutica para el tratamiento y/o la prevenciïn de una afecciïn asociada a la disfunciïn de balsas lipïdicas y/o caveolas en membranas celulares, donde dicha afecciïn se selecciona del grupo que consiste en disfunciïn vascular, disfunciïn cardiovascular, disfunciïn pulmonar, diabetes mellitus, complicaciones relacionadas con diabetes mellitus,

hiperplasia y/o hipertrofia de cïlulas y/o tejido, cardiomiopatïa, trastorno pulmonar y tumores y complicaciones de los mismos, o para uso terapïutico para facilitar una mejor biointegraciïn de material extraïo implantado en un mamïfero.

Figura 1