Uso de microRNAs para el control de ácidos nucleicos colaboradores de virus.

Un ácido nucleico colaborador que comprende:

(a) una secuencia de reconocimiento de la replicación en 5' de un alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína estructural de un alfavirus;

(c) una secuencia de reconocimiento de la replicación en 3' de un alfavirus; y

(d) al menos una secuencia de microARN objetivo de un microARN endógeno celular.

Uso de microRNAs para el control de ácidos nucleicos colaboradores de virus 5 Antecedentes

[1] Las estrategias modernas de vacunación y terapia génica implican a menudo el uso de vectores víricos. Esto se basa en el hecho de que los virus han desarrollado técnicas útiles para la invasión del hospedador y la autopropagaclón. El objetivo es aprovechar esas técnicas para administrar antígenos inmunizantes desde un

organismo o un virus patológico objetivo, incapacitando al mismo tiempo al propio virus de forma que no pueda propagarse y provocar una enfermedad en su hospedador. La estrategia más simple ha sido el uso de virus vivos atenuados, pero esta solución está limitada obviamente a las vacunas para enfermedades víricas. Aun así, existe una preocupación porque dichos virus atenuados pueden mutary hacerse más virulentos para el hospedador. Una estrategia más dirigida es el diseño de un vector basado en un virus, pero proporcionar únicamente los elementos 15 necesarios para que el virus se replique en una célula, en lugar de que se propague y se disemine por todo el hospedador. Los alfavirus han sido un tipo de virus atractivo para su uso en el diseño de dichos sistemas. Otros sistemas son los flavivirus, los herpesvirus, los lentivirus y los adenovirus.

[2] Todos estos virus de ciclo único o restringido utilizan sistemas "colaboradores" que proporcionan por 2 separado alguna función del virus parental del que derivan. Estos sistemas colaboradores son necesarios para la

producción de partículas víricas individuales o restringidas, pero idealmente no son portados junto con esas partículas ni recombinados con los ácidos nucleicos de las partículas. Sin embargo, siempre que están presentes todas las porciones de un genoma vírico en una célula al mismo tiempo, incluso si sólo es temporalmente, existe la posibilidad de que esos elementos se recombinen para producir el virus parental.

[3] Pushko y col. en "Replicon-Helper Systems from Attenuated Venezuelan Equine Encephalitis Virus: Expression of Heterologous Genes in Vitro and Immunization against Heterologous Pathogens in Vivo", Virology 239 (2): 389 - 41 (1997) divulgan constructos de colaboradores de alfavirus, que son profundamente mutados para producir cualquier virus resultante atenuado.

[4] Barnes y col. en "Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines", Cell Host and Microbe, vol. 4, n° 3, 11 de septiembre de 28 (28-9-11), páginas 239 - 248, divulgan una estrategia general para un diseño racional de vacunas de virus vivos seguras y eficaces que se aprovechan de la maquinaria de silenciación génica basada en microARN para controlar la

replicación de poliovirus. Se divulga que pueden incorporarse secuencias de miARN objetivo en el genoma de un poliovirus, que pueden y de hecho dan lugar a eludir la inhibición del miARN mediada por el virus en un sujeto infectado.

[5] Kelly y col. en "Engineering microRNA responsiveness to decrease virus pathogenicity", Nature Medicine, 4 Nature Publishing Group, Nueva York, EE.UU., vol. 14, n° 11, 1 de noviembre de 28 (28-11-1), páginas 1278 -

1283, divulgan que pueden incorporarse secuencias de miARN de miARN endógenos en el genoma completo de un picornavirus, que pueden y de hecho dan lugar a eludir la inhibición del miARN mediada por el virus en un sujeto infectado.

[6] La solicitud internacional WO 24/8566 divulga numerosos constructos colaboradores útiles para la expresión de proteínas estructurales de alfavirus en la producción de ARPs.

Resumen de la divulgación

[7] En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos colaboradores según se define en las reivindicaciones que comprenden al menos una secuencia objetivo del microARN de un microARN endógeno celular y un ácido nucleico que codifica para una proteína vírica, en las que la secuencia objetivo del microARN está ubicada en la región no traducida o traducida del ácido nucleico que codifica para la proteína vírica. La proteína vírica es una proteína estructural o una proteína esencial para la replicación del virus. La proteína vírica es una

proteína estructural de un alfavirus. También se proporcionan sistemas de vector, composiciones y células que

comprenden los ácidos nucleicos colaboradores proporcionados, y un vector o replicón.

[8] Se proporcionan métodos según se definen en las reivindicaciones para la elaboración de partículas de replicón semejantes a virus (VRP) (por ejemplo, partículas de replicón semejantes a alfavirus (ARP)) que

comprenden la transfección de una célula con un replicón, en la que el replicón comprende una señal de

empaquetamiento y uno o más de los ácidos nucleicos colaboradores descritos en el presente documento. Las proteínas necesarias para crear las VRP están codificadas por uno o más de la célula, el replicón o el ácido nucleico colaborador. Entonces la célula se cultiva en unas condiciones que permitan la producción de las partículas de replicón semejantes a virus ensambladas que comprenden el replicón.

[9] Se proporcionan poblaciones de partículas de replicón semejantes a alfavirus (ARP) que comprenden (i) un primer subconjunto de partículas que comprende un replicón y (¡i) un segundo subconjunto de partículas que comprende el uno o más ácidos nucleicos colaboradores proporcionados, o un fragmento de los mismos, y un replicón.

[1] Los detalles de una o más de las composiciones y los métodos se establecen en los dibujos anexos y en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas serán apreciables a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

[11]

La Figura 1 es una representación esquemática de la ubicación de los miARN objetivo modificados en la UTR en 15 3 de un ácido nucleico que codifica para una proteína estructural. Puede aparecer una longitud de nucleótidos

de 1.533 pares de bases cuando la proteína estructural es, por ejemplo, la proteína de la cápside. La longitud de nucleótidos de 1.533 pares de bases se mide desde el extremo del promotor T7 hacia el sitio de restricción Notl. La Figura 2 es una representación esquemática de la ubicación de los miARN objetivo modificados en la UTR en 5 de un ácido nucleico que codifica para una proteína estructural. Puede aparecer una longitud de nucleótidos 2 de 1.533 pares de bases cuando la proteína estructural es, por ejemplo, la proteína de la cápside. La longitud de nucleótidos de 1.533 pares de bases se mide desde el extremo del promotor T7 hacia el sitio de restricción Notl. La Figura 3 es una representación esquemática de la ubicación de los miARN objetivo modificados en la UTR en 5 y en 3 de un ácido nucleico que codifica para una proteína estructural. Puede aparecer una longitud de nucleótidos de 1.647 pares de bases cuando la proteína estructural es, por ejemplo, la proteína de la cápside. La 25 longitud de nucleótidos de 1.647 pares de bases se mide desde el extremo del promotor T7 hacia el sitio de restricción Notl.

La Figura 4 es una ¡nmunotransferencia Western de la expresión de la proteína de la cápside y de la glucoproteína (gp) mediante el uso de colaboradores de la cápside y de la gp con secuencias de microARN objetivo emparejadas. Se electroporaron células Vero con conjuntos de tres ARNs como sigue: (i) un vector de 3 replicón, con un colaborador de la cápside que comprende los miARN objetivo RC1-6 y colaborador de gp que comprende los miARN objetivo RC1-6, o (ii) un vector de replicón, con colaboradores de la cápside y de la gp que comprenden bien los miARN RC1-3 objetivo o bien los miARN RC4-6 objetivo. Cada una de las combinaciones de colaborador y replicón se electroporaron en presencia y en ausencia de los inhibidores de miARN (oligonucleótidos de ARN metilados en 2-) específicos para completar completamente el miARN 35 objetivo presente en los colaboradores. Las combinaciones de ARN colaborador con los miARN objetivo RC1-3 o los RC4-6 también se electroporaron en presencia de los Inhibidores de miARN no emparejados para demostrar la especificidad de los inhibidores usados. Las células electroporadas se sembraron en medio y se incubaron durante una noche. Después de la incubación (~ 18 horas), se recogieron las partículas de replicón del virus de la encefalitis equina de Venezuela (VEE RP).

La Figura 5 es una ¡nmunotransferencia Northern de la repllcaclón del ARN de la cápside y de la gp mediante el uso de colaboradores de la cápside y de la gp con secuencias de microARN objetivo emparejadas e inhibidores. Las muestras se prepararon según se ha descrito en la... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico colaborador que comprende:

(a) una secuencia de reconocimiento de la replicación en 5 de un alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína estructural de un alfavirus;

(c) una secuencia de reconocimiento de la replicación en 3 de un alfavirus; y

(d) al menos una secuencia de microARN objetivo de un microARN endógeno celular.

2. El ácido nucleico colaborador de la reivindicación 1, en el que la secuencia de microARN objetivo tiene una complementariedad de al menos el 7 % con el microARN endógeno celular, o

en el que al menos una secuencia de microARN objetivo está ubicado en una UTR en 3 o en una UTR en 5 de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína estructural del alfavirus, o en el que al menos una secuencia de microARN objetivo está ubicado en una UTR en 3 de la secuencia de ácido nucleico que codifica para 15 la proteína estructural del alfavirus y al menos una secuencia objetivo de un microARN está ubicado en una UTR en 5 de la secuencia del ácido nucleico que codifica para la proteína estructural del alfavirus, o

en el que al menos una secuencia de un microARN objetivo está ubicada en la región traducida de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína estructural del alfavirus.

3. El ácido nucleico colaborador de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la proteína estructural del alfavirus es una proteína estructural del virus de la encefalitis equina de Venezuela (VEE), o en el que la proteína estructural del alfavirus se elige de entre el grupo que consiste en una proteína estructural del Arbovirus surafricano N° 86, del virus de Sindbis, del virus del bosque de Semliki y del virus de Ross River.

4. El ácido nucleico colaborador de la reivindicación 1, el que la proteína estructural del alfavirus es una proteína de la cápside de un alfavirus, en el que el gen de la cápside ha eliminado la actividad de autoproteasa pero la función de empaquetamiento del ARN permanece inalterada, en el que opcionalmente la proteína de la cápside del alfavirus es una proteína de la cápside del VEE, que preferiblemente comprende una o más sustituciones de aminoácido en el residuo de aminoácido 152, 174 ó 226.

5. El ácido nucleico colaborador de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ácido nucleico colaborador comprende al menos dos secuencias de microARN objetivo.

6. Una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos colaboradores de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 35 en la que la célula es una célula de empaquetamiento y se transforma de manera estable con al menos un ácido

nucleico colaborador.

7. Una célula o una composición que comprende

(a) un primer ácido nucleico colaborador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y

(b) un replicón de un alfavirus.

8. La célula o la composición de la reivindicación 7, en la que el primer ácido nucleico colaborador codifica para al menos una, pero no todas, las proteínas estructurales necesarias para crear una partícula de replicón semejante a

virus, y que comprende adicionalmente un segundo ácido nucleico colaborador que comprende al menos una secuencia de un microARN objetivo de un microARN endógeno celular y una secuencia de un ácido nucleico que codifica para una proteína estructural del alfavirus, en la que el segundo ácido nucleico colaborador codifica para al menos una o más de las proteínas estructurales del alfavirus no codificadas por el primer ácido nucleico colaborador.

9. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 7-8, que comprende adicionalmente un inhibidor del al menos un microARN endógeno celular, en donde la célula comprende además opcionalmente un ácido nucleico que codifica para el inhibidor del microARN celular.

1. Una población de partículas de replicón semejantes a alfavirus (ARPs) que comprende (i) un primer subconjunto

de partículas que comprende un replicón y (ii) un segundo subconjunto de partículas que comprende el ácido

nucleico colaborador de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o un fragmento de las mismas, en el que el fragmento comprende al menos una secuencia de un microARN objetivo de un microARN endógeno celular, y un replicón.

11. Un método para la elaboración in vitro de partículas de replicón semejantes a alfavirus (ARPs) que comprende:

(a) transfectar una célula con (i) un replicón, y (ii) uno o más ácidos nucleicos colaboradores de acuerdo con

cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que las proteínas estructurales del alfavirus necesarias para la elaboración de las ARPs están codificadas por uno o más de la célula, el replicón o el uno o más ácidos 65 nucleicos colaboradores; y

(b) cultivar la célula en unas condiciones que permitan la producción de las ARPs ensambladas que comprenden el replicón; y

(c) aislar las ARPs.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la célula se transfecta con un primer ácido nucleico colaborador y con un segundo ácido nucleico colaborador, en el que el primer y el segundo ácido nucleico colaborador codifican para las proteínas estructurales del alfavirus necesarias para la elaboración de las ARPs, y en el que el segundo ácido nucleico colaborador codifica para al menos una o más proteínas estructurales del alfavirus no codificadas por el primer ácido nucleico colaborador; y en el que la célula de empaquetamiento opcionalmente no contiene el

microARN celular que reconoce la secuencia de un microARN objetivo presente en el ácido nucleico colaborador.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que la célula se cultiva en presencia de un inhibidor de al menos un microARN endógeno celular.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-12 o la población de la reivindicación 1, en el que las ARPs son ARPs del virus de la encefalitis equina de Venezuela (VEE), o en el que la ARP se elige de entre el grupo que consiste en ARPs del Arbovirus surafricano N° 86, del virus de Sindbls, del virus del bosque de Semliki y del virus Ross River.

15. La población de partículas de replicón semejantes a alfavirus de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 14, o elaboradas mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para su uso en la Inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto.