Replicones de alfavirus mejorados y constructos cooperadores.

Un ácido nucleico replicón recombinante que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 5' alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del alfavirus no estructural;

(c) un casete promotor subgenómico de alfavirus-IRES-ácido nucleico heterólogo de interés (NOI), que está en orientación 5' a 3'; y

(d) un ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 3' alfavirus

Replicones de alfavirus mejorados y constructos cooperadores.

Campo de la invención La presente invención se relaciona con constructos mejorados para y con métodos para preparar partículas de alfavirus recombinantes.

Antecedentes de la invención En eucariotas, se han desarrollado en las células dos mecanismos distintos para iniciar la traducción. En uno de ellos, la estructura metil-7-guanosina (5') pppN presente en el terminal 5' del ARNm (el "cap") se reconoce por el factor de iniciación eIF4F, que está compuesto por eIF4E, eIF4G y eIF4A. La formación de este "complejo de preiniciación" requiere, entre otros factores, la acción concertada del factor de iniciación eIF2, responsable de la unión al iniciador ARNt -Meti, y eIF3, que interactúa con la subunidad ribosomal 40S (Hershey & Merrick. Translational Control of Gene Expression, págs. 33-88, Cold Spring Harbor Laborator y Press, NY 2000) .

En el mecanismo alternativo, la iniciación de la traducción ocurre internamente en el transcripto y está mediada por un elemento de la secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES) que recluta la maquinaria de traducción hacia un codón de iniciación interno en el ARNm con la ayuda de factores de acción trans (Jackson. Translational Control of Gene Expression, págs. 127-184, Cold Spring Harbor Laborator y Press, NY 2000) . Elementos IRES se han encontrado en numerosos transcriptos a partir de los virus que infectan a las células de vertebrados, invertebrados,

o de plantas, así como en transcriptos a partir de genes de vertebrados e invertebrados.

Durante muchas infecciones virales, así como en otras condiciones de estrés celular, cambios en el estado de fosforilación de eIF2, que reducen los niveles del complejo ternario eIF2 -GTP -ARNt -Meti, resultan en la inhibición total de la síntesis de proteínas. Al contrario, el cierre específico de la iniciación cap-dependiente depende de la modificación de la funcionalidad de eIF4F (Thompson & Sarnow. Current Opinion in Microbiology 3:366-370 (2000) ) .

Elementos IRES desvían la inhibición de la traducción cap-dependiente; así la traducción dirigida por un elemento IRES se denomina "cap-independiente." La iniciación de la traducción impulsada por IRES prevalece durante muchas infecciones virales, tales como, por ejemplo, la infección picornaviral (Macejak & Sarnow. Nature 353:90-94 (1991) ) . Bajo estas circunstancias, la iniciación cap-dependiente se inhibe o compromete severamente debido a la presencia de pequeñas cantidades de eIF4F funcional. Esto es causado por escisión o la pérdida de solubilidad de eIF4G (Gradi y otros Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95:11089-11094 (1998) ) ; desfosforilación de 4E-BP (Gingras y otros Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 93:5578-5583 (1996) ) o escisión de la proteína de unión a poli (A) (PABP) (Joachims y otros Journal of Virology 73:718-727 (1999) ) .

Los vectores de alfavirus que expresan un ácido nucleico de interés (NOI) a niveles variables se han descrito. Todos los ejemplos describen la modificación de los genes de proteínas no estructurales de alfavirus o del promotor 26S (subgenómico) para regular la replicación del vector o transcripción a partir del promotor subgenómico. Los ejemplos incluyen mutaciones en los genes de proteínas no estructurales que aumentan o disminuyen la transcripción del ARN subgenómico o alteran la replicación del ARN genómico, lo que resulta en la expresión del NOI modificado. El control de la expresión de proteínas a partir de un vector de alfavirus, en el nivel de la traducción del ARNm subgenómico, no se ha descrito previamente.

Rayner JO y otros (Rev Med Virol. 2002 Sep-Oct;12 (5) :279-96) describen vectores de expresión que se diseñaron a partir de al menos tres alfavirus en los que la región del gen de la proteína estructural se reemplazó por genes heterólogos y se mostró que expresa altos niveles de la proteína heteróloga en las células cultivadas. Estos vectores de ARN (replicones) son capaces de autoreplicarse, pero no se empacan en partículas tipo-virus a menos que las proteínas estructurales sean proporcionadas en trans, y por lo tanto son incapaces de extenderse de las células infectadas a no infectadas.

Pushko P y otros (Virology. 1997 Dic 22;239 (2) :389-401) describen los sistemas replicón- cooperador del virus de la encefalitis equina venezolana atenuado, y la expresión de los genes heterólogos in vitro e inmunización contra patógenos heterólogos in vivo.

La presente invención proporciona vectores de alfavirus replicones y cooperadores diseñados para controlar la expresión de una o más secuencias heterólogas de ácido nucleico en el nivel de traducción de proteínas a través de un mecanismo cap-independiente bajo la dirección de un elemento IRES.

Resumen de la invención En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico replicón recombinante que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación 5' del alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína no estructural de alfavirus;

(c) un casete de promotor subgenómico-IRES-ácido nucleico de interés (NOI) de alfavirus, que está en la orientación de 5' a 3'; y

(d) un ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación 3' del alfavirus.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico cooperador recombinante que comprende:

(a) una secuencia de reconocimiento de la replicación 5' del alfavirus;

(b) un casete promotor subgenómico-IRES-NOI heterólogo de alfavirus, que está en la orientación 5' a 3', en donde el NOI codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus; y

(c) una secuencia de reconocimiento de la replicación 3' del alfavirus.

Se proporciona además en la presente descripción una partícula de alfavirus que comprende un ARN replicón de alfavirus que comprende el ácido nucleico replicón recombinante de esta invención. En una modalidad adicional, se proporciona en la presente descripción una población de partículas de alfavirus infecciosas, defectuosas, en donde cada partícula contiene un ARN replicón de alfavirus que comprende un ácido nucleico replicón recombinante de esta invención. En algunas modalidades, la invención proporciona una población de partículas de alfavirus, infecciosas, defectuosas en donde cada partícula contiene un ARN replicón de alfavirus que comprende un ácido nucleico replicón recombinante de esta invención, y la población no tiene virus competente de replicación detectable, como se mide mediante el paso en cultivo celular. En modalidades específicas, las partículas de esta invención pueden contener uno o más mutaciones atenuantes.

Adicionalmente, se incluyen las composiciones farmacéuticas, que comprenden las partículas y poblaciones de esta invención en un portador farmacéuticamente aceptable.

En otras modalidades, la presente invención proporciona un método para preparar partículas de alfavirus defectuosas infecciosas, que comprenden:

a) introducir en una célula lo siguiente:

(i) un ácido nucleico replicón recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y

(ii) uno o más ácidos nucleicos cooperadores que codifican proteínas estructurales de alfavirus, en donde uno o más ácido nucleico cooperador produce todas las proteínas estructurales de alfavirus, y

b) producir dichas partículas de alfavirus en la célula.

El método de esta invención puede comprender además la etapa de recoger dichas partículas de alfavirus de las células.

En algunas modalidades, el ácido nucleico cooperador puede ser además un ácido nucleico replicón recombinante de esta invención. Por ejemplo, un ácido nucleico recombinante de esta invención puede comprender, como un ácido nucleico heterólogo y/o adicionalmente un ácido nucleico heterólogo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína estructural de alfavirus o más de una proteína estructural de alfavirus. En tales modalidades, el ácido nucleico replicón recombinante se considera a un ácido nucleico cooperador replicón recombinante, que puede estar presente en una célula con otros ácidos nucleicos cooperadores y/u otros ácidos nucleicos recombinantes de esta invención.

Así, en una modalidad específica, el ácido nucleico replicón recombinante de esta invención codifica además una proteína estructural de alfavirus o más de una proteína estructural de alfavirus. Este ácido nucleico replicón recombinante... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico replicón recombinante que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 5' alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del alfavirus no estructural;

(c) un casete promotor subgenómico de alfavirus-IRES-ácido nucleico heterólogo de interés (NOI) , que está en orientación 5' a 3'; y

(d) un ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 3' alfavirus.

2. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 1, en donde el casete promotor subgenómico de alfavirus-IRES-NOI heterólogo comprende además una secuencia de ácido nucleico no codificante espaciadora situada 3' al promotor subgenómico de alfavirus y 5 ' al IRES.

3. Un ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de ácido nucleico de (b) es una secuencia de nucleótidos contigua que codifica para las proteínas no estructurales de alfavirus nsp1, nsp2, nsp3 y nsp4.

4. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de ácido nucleico de (b) es una secuencia de nucleótidos contigua que codifica para las proteínas no estructurales de alfavirus nsp1, nsp2 y nsp3 y en donde el ácido nucleico replicón recombinante comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína no estructural de alfavirus nsp4 que no es contigua con la secuencia de ácido nucleico de (b) .

5. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el IRES se selecciona del grupo que consiste de IRES celulares, IRES de plantas, IRES de virus de mamífero, IRES sintéticos y IRES de virus de insectos.

6. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el promotor subgenómico de alfavirus de (c) es un promotor subgenómico de alfavirus mínimo o modificado.

7. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el NOI heterólogo de (c) codifica una proteína o péptido.

8. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 7 en donde el péptido es un Inmunógeno.

9. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el NOI heterólogo de (c) es una secuencia antisentido.

10. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el NOI heterólogo de (c) codifica un ribozima.

11. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de alfavirus.

12. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 11, en donde la proteína estructural de alfavirus es de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste de virus Sindbis, SFV, VEE, virus S.A. AR86, virus Ross River, EEE y WEE.

13. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de ácido nucleico de (a) es de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste de virus Sindbis, SFV, VEE, virus S.A. AR86, virus Ross River, EEE y WEE.

14. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de ácido nucleico de (b) es de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste de virus Sindbis, SFV, VEE, virus S.A. AR86, virus Ross River, EEE y WEE.

15. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el promotor subgenómico del alfavirus de (c) es de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste de virus Sindbis, SFV, VEE, virus S.A. AR86, virus Ross River, EEE y WEE.

16. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico de (d) es de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste de virus Sindbis, virus SFV, VEE, S.A. AR86, virus Ross River, EEE y WEE.

17. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico es ARN.

18. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico es ADN.

19. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 2, en donde la secuencia de ácido nucleico nocodificante espaciadora es al menos 30 nucleótidos de longitud.

20. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 2, en donde la secuencia de ácido nucleico nocodificante espaciadora está entre 25 y 7500 nucleótidos de longitud.

21. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 2, en donde la secuencia de ácido nucleico nocodificante espaciadora está entre 25 y 1000 nucleótidos de longitud.

22. El ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una mutación de atenuación.

23. Un ácido nucleico replicón recombinante que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 5' alfavirus;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína del alfavirus no estructural;

(c) un primer casete promotor subgenómico de alfavirus-IRES-NOI heterólogo, que está en la orientación 5' a 3;

(d) un segundo casete promotor subgenómico de alfavirus-IRES-NOI heterólogo, que está en la orientación 5' a 3'; y

(e) un ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento de la replicación del 3' alfavirus.

24. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 23, en donde el primero y segundo casetes promotor subgenómico de alfavirus-IRES-NOI heterólogo comprende además una secuencia de ácido nucleico no codificante espaciadora situada 3' al promotor subgenómico de alfavirus y 5' al IRES

25. El ácido nucleico replicón recombinante de la reivindicación 23 o 24, que comprende además una señal de empaquetamiento de alfavirus.

26. Una población de partículas de alfavirus infecciosas, defectuosas, en donde cada partícula comprende el ácido nucleico replicón recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

27. Una población de partículas de alfavirus infecciosas, defectuosas de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la población no tiene virus competente de replicación detectable, como se midió por el paso en cultivo celular.

28. Una composición farmacéutica que comprende la población de la reivindicación 26 o 27 en un portador farmacéuticamente aceptable.

29. Una partícula de alfavirus que comprende un ácido nucleico replicón recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

30. La partícula de alfavirus de la reivindicación 29, que comprende una mutación de atenuación.

31. Un ácido nucleico recombinante que comprende:

(a) una secuencia de reconocimiento de la replicación del 5' alfavirus;

(b) un casete promotor subgenómico de alfavirus- IRES-NOI heterólogo, que está en la orientación 5' a 3', en donde el NOI codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus; y

(c) una secuencia de reconocimiento de la replicación del 3' alfavirus.

32. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 31, en donde los casetes promotor subgenómico de alfavirus-IRES-NOI heterólogo comprenden además una secuencia de ácido nucleico no codificante espaciadora situada 3' respecto al promotor subgenómico de alfavirus y 5' al IRES.

33. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 31 o 32.

34. El ácido nucleico de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende una señal de empaquetamiento del alfavirus.

35. Un método in vitro para preparar partículas de alfavirus defectuosas infecciosas, que comprende :

a) introducir en una célula lo siguiente:

(i) un ácido nucleico replicón recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y

(ii) uno o más ácidos nucleicos cooperadores que codifican las proteínas estructurales de alfavirus, en donde uno o más ácidos nucleicos cooperadores producen todas las proteínas estructurales de alfavirus; y

b) producir dichas partículas de alfavirus en la célula.

36. El método de la reivindicación 35, en donde el ácido nucleico replicón recombinante adicional comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de alfavirus.

37. El método de la reivindicación 35, en donde el ácido nucleico cooperador es un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de reconocimiento de replicación del 5' alfavirus, un promotor subgenómico de alfavirus, un ácido nucleico que codifica una proteína estructural del alfavirus y una secuencia de reconocimiento de replicación del 3' alfavirus.

38. El método de la reivindicación 35, en donde el ácido nucleico cooperador es un ácido nucleico recombinante que comprende un promotor y secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas estructurales de alfavirus.

39. El método de la reivindicación 38, en donde el ácido nucleico cooperador es ADN.

40. El método de la reivindicación 38, en donde el promotor es un promotor CMV.

41. El método de la reivindicación 38, en donde el ácido nucleico cooperador comprende las secuencias de nucleótidos que codifican todas las proteínas estructurales de alfavirus.

42. El método de la reivindicación 35, en donde el ácido nucleico cooperador es un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de reconocimiento de replicación del 5' alfavirus, un elemento IRES, un ácido nucleico que codifica una proteína estructural del alfavirus y una secuencia de reconocimiento de replicación del 3' alfavirus.

43. Un método in vitro para preparar partículas de alfavirus defectuosas, infecciosas, que comprende:

a) introducir en una célula lo siguiente:

i) un ARN replicón de alfavirus que comprende una secuencia de reconocimiento de replicación del 5' alfavirus, secuencia (s) de ácido (s) nucleico (s) que codifica (n) proteínas no estructurales de alfavirus, un promotor subgenómico de alfavirus, una secuencia de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de reconocimiento de replicación del 3' alfavirus; y ii) uno o más ácidos nucleicos cooperadores que codifican proteínas estructurales de alfavirus que comprenden un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 31 o 32, en el que todas las proteínas estructurales de alfavirus se producen en la célula; y

b) producir dichas partículas de alfavirus en la célula.

44. Un método in vitro para preparar partículas de alfavirus defectuosas, infecciosas que comprende:

a) introducir en una célula lo siguiente:

i) un ácido nucleico replicón recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2; y ii) uno o más ácidos nucleicos cooperadores que codifican proteínas estructurales de alfavirus que comprenden un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 31 o 32, en el que todas las proteínas estructurales de alfavirus se producen en la célula; y

b) producir dichas partículas de alfavirus en la célula.

45. La población de la reivindicación 26 o 27 o la composición farmacéutica de la reivindicación 28 para el uso al inducir una respuesta inmune en un sujeto.

46. Una partícula de alfavirus defectuosa infecciosa producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 42 o 44.