Uso de la racemasa BsrV para la racemización de aminoácidos.

Uso de la racemasa BsrV para la racemización de aminoácidos.

La presente invención se refiere al uso de la racemasa BsrV,

la cual se puede obtener de Vibrio cholerae, para la racemización de aminoácidos y por tanto para la obtención de D-aminoácidos a partir de L-aminoácidos y de L-aminoácidos a partir de D-aminoácidos. Además la presente invención se refiere a un método de racemización de aminoácidos y de síntesis de muropéptidos.

Uso de la racemasa BsrV para la racemización de aminoácidos.

La presente invención se refiere al uso de la racemasa BsrV para la obtención de D-aminoácidos a partir de Laminoácidos o bien de L-aminoácidos a partir de D-aminoácidos mediante su racemización. La presente invención también se refiere a un método de racemización de aminoácidos así como de síntesis de muropéptidos a partir de otros muropéptidos. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En todos los seres vivos, los aminoácidos predominantes son los L-enantiómeros. Sin embargo, algunas bacterias son capaces de producir D-aminoácidos no canónicos (NCDAAs) - así llamados por ser distintos a los encontrados (D-Alanina y D-Glutámico) de forma habitual en el peptidoglicano (PG) y liberarlos al ambiente extracelular en concentraciones milimolares.

Uno de los papeles de los aminoácidos NCDAAs parece ser influenciar la composición, y fuerza del PG en bacterias, de forma que estas bacterias se puedan adaptar a los cambios en el entorno.

No obstante, el papel de los NCDAAs en el medio extracelular no queda restringido al PG, sino que además estos aminoácidos intervienen en procesos como; la inhibición de la germinación de esporas en las especies del género Bacillus (Atluri et al. J. Bacteriol. 2006, 188 (1) : 28-36) y la dispersión del biofilm en comunidades bacterianas para pasar a una vida plactónica cuando escasean los nutrientes (Kolodkin et al. Science. 2010, 328 (5978) : 627-629) .

Dada la utilidad de los D-aminoácidos por ejemplo en terapia antimicrobiana (como sustratos para la síntesis de antibióticos, inhibidores de la germinación, compuestos anti-biofilm) resulta interesante su obtención a nivel industrial de forma que se obtenga un producto barato. Por ejemplo, se pueden obtener D-aminoácidos a partir de Laminoácidos los cuales son abundantes en la naturaleza. Esta opción se ha explorado mediante el uso de catalizadores químicos como el piridoxal fosfato (Toth et al. J Am Chem Soc. 2007, 129:3013-3021) o el ácido salicílico (Gong et al. Inorg Chem. 2010, 49:7692-7699) . Sin embargo la producción a través de catalizadores químicos resulta costosa y presenta un bajo rendimiento lo que hace que el producto final tenga un alto costo y por tanto la obtención de estos D-aminoácidos y posterior utilización resulte cara.

Por tanto resulta necesaria la búsqueda de otras formas de obtener estos aminoácidos de manera que se puedan evitar estas limitaciones y acelerando el proceso de obtención de D-aminoácidos. Un ejemplo puede ser la obtención de D-aminoácidos a partir de L-aminoácidos mediante el uso de biocatalizadores enzimáticos apropiados: las racemasas de aminoácido. Sin embargo, el principal inconveniente que presenta este procedimiento es que las racemasas de aminoácido actualmente descritas presentan especificidad por un único sustrato por lo que se necesitaría una enzima para cada aminoácido que se quiera producir. Esta opción es, sin embargo, por el momento inviable ya que no se conocen aun suficientes tipos de racemasas monoespecificas como para, combinadas, llevar a cabo este proceso. .

Por tanto sigue resultando necesaria la búsqueda de elementos que permitan la obtención de D-aminoácidos a partir de L-aminoácidos de forma sencilla, y que además presenten multiespecificidad de forma que de una mezcla compleja de L-aminoácidos se obtengan diversos D-aminoácidos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de la enzima BsrV (Broad spectrum racemase in Vibrio, o racemasa de Vibrio de amplio espectro) , para la racemización de diferentes aminoácidos.

En la presente invención se demuestra como la enzima BsrV de Vibrio cholerae es una enzima multiespecífica, la cual presenta la capacidad de transformar algunos L-aminoácidos o D-aminoácidos puros tanto naturales como nonaturales en mezclas de D-aminoácidos y L-aminoácidos hasta alcanzar un equilibrio sin la necesidad de un aporte exógeno de energía. De esta forma se demuestra la capacidad de la enzima para racemizar estos aminoácidos. Sin embargo esta capacidad se encuentra limitada a ciertos aminoácidos ya que tal y como se demuestra en losejemplos, esta enzima no puede racemizar algunos aminoácidos naturales como Prolina, Ácido glutámico, Ácido aspártico, Fenilalanina, Tirosina, Treonina o Triptófano. Sin embargo, en la presente invención se demuestra como BsrV presenta capacidad de racemizar aminoácidos aminoácidos básicos como son por ejemplo Histidina, Lisina, Asparagina, Glutamina, Arginina, Ornitina, y Ácido 2, 4-diaminobutírico. Además se demuestra que BsrV permite racemizar otros aminoácidos tanto naturales como no naturales como por ejemplo Alanina, Cisteína, Serina, βcloroalanina, Norleucina, Fenilglicina, Homoserina, y N-acetil-lisina metil éster.

Dado que cada uno de los enantiómeros presenta diferentes utilidades, resulta particularmente útil la capacidad que tiene BsrV de racemizar aminoácidos en los dos sentidos y de este modo promover la formación o la eliminación de uno u otro enantiómero. Igualmente resulta interesante la capacidad de la enzima para alcanzar el equilibrio de reacción partiendo de cantidades puras de uno de los enantiómeros o bien de alcanzar un equilibrio a partir de mezclas con diferentes cantidades de cada uno de los enantiómeros. El punto de equilibrio se alcanza dejando evolucionar la reacción. Sin embargo puntos cercanos al equilibrio se alcanzan rápidamente y varían en función del tiempo que se deje evolucionar la reacción. Además la enzima presenta la capacidad de racemizar diferentes aminoácidos presentes en mezclas racémicas o enantioméricas impuras de los mismos, las cuales son mezclas de aminoácidos fáciles y baratas de obtener.

Por todo ello un primer aspecto de la invención se refiere al uso de de la enzima BsrV, de ahora en adelante enzima o péptido de la invención, como reactivo para la racemización de al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende Alanina, Arginina, Asparagina, Cisteína, Glutamina, Histidina, Lisina, Serina, Ornitina, β-cloroalanina, 2, 4-diaminobutirico, Norleucina, Fenilglicina, Homoserina, y N-acetil-lisina metil éster. En una realización preferida el aminoácido es un aminoácido básico.

Se entiende por “BsrV” (Broad spectrum racemase in Vibrio, o racemasa de Vibrio de amplio espectro) o “enzima BsrV” en la presente invención a la proteína codificada por el locus vc1312 de Vibrio cholerae N16961 y que presenta la secuencia amino acídica SEQ ID NO:1. De igual forma que ocurre con muchas de las proteínas descritas, como por ejemplo entre proteínas homólogas en diferentes organismos, BsrV podría tener alterado algún residuo amino acídico con respecto a SEQ ID NO:1 sin que se produjera una alteración sustancial en la proteína. Esto significa que esta alteración no sería determinante en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad. La enzima BsrV puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia amino acídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de la enzima. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoácidos que presentan similares características como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamaño o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp) , entre Lisina (Lys) y Arginina (Arg) , entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln) , entre serina (Ser) y treonina (Thr) , y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala) , leucina (Leu) , valina (Val) e isoleucina (Ile) . Las variaciones pueden ser variaciones existentes en la naturaleza como por ejemplo variaciones alélicas, o generadas artificialmente como por ejemplo mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del polipéptido, por lo que dichas variantes mantienen su actividad biológica. Todos estos péptidos pueden ser péptidos presentes en la naturaleza o bien ser producidos de forma artificial como por ejemplo, aunque sin limitarse, de forma recombinante, de forma sintética, o mediante la combinación de estos 2 métodos.

Se entiende por “aminoácido no canónico” o “NCDAA” en la presente invención, a aquellos aminoácidos distintos de alanina y ácido glutámico, por formar parte del PG de todas las bacterias conocidas.... [Seguir leyendo]

1. Uso de la enzima BsrV como reactivo para la racemización de al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende Alanina, Arginina, Asparagina, Cisteina, Glutamina, Histidina, Lisina, Serina, Ornitina, βcloroalanina, 2, 4-diaminobutirico, Norleucina, Fenilglicina, Homoserina, y N-acetil-lisina metil éster.

2. Uso según la reivindicación 1 donde el aminoácido es un aminoácido básico.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la racemización se hace a partir de una mezcla enantiomérica.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la racemización se hace a partir de un enantiómero puro.

5. Usó según la reivindicación 4 donde el enantiómero puro es el enantiómero L.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la racemización se hace a partir de una mezcla de aminoácidos.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde BsrV se encuentra inmovilizada.

8. Método de producción de muropéptidos que comprende: a) Poner en contacto al menos un L-aminoácido Alanina, Arginina, Asparagina, Cisteína, Glutamina, Histidina, Lisina, Serina, Ornitina, β-cloroalanina, 2, 4-diaminobutirico, Norleucina, Fenilglicina, Homoserina, y N-acetillisina metil éster con la enzima BsrV para racemizar el aminoácido a su forma D, y b) poner en contacto el D-aminoácido obtenido en (a) con un muropéptido y al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa.

9. Método según la reivindicación 8 donde el aminoácido de (a) es un aminoácido básico.

10. Método según la reivindicación 9 donde la L, D transpeptidasa del paso (b) es LdtA.

11. Método según la reivindicación 10 donde LdtA carece del dominio transmembrana.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 donde la ligasa del paso (b) es Vc-Ddl y/o Vc-MurF.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 donde el muropéptido que se sintetiza es un muropéptido no canónico.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en forma de mezcla enantiomérica.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 donde el aminoácido de partida se encuentra en una forma enantiomérica pura.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 donde el aminoácido de partida se encuentra en una mezcla de aminoácidos.