Un método para la detección de un tipo de virus del papiloma humano (HPV).

Un método para detectar y/o tipificar y/o cuantificar simultáneamente la presencia de HPV 18,

52, 59, 39, 51, 56, 66, 16, 45, 58, 31, 33 y 35 en una muestra biológica, comprendiendo el método las siguientes cuatro reacciones paralelas:

Reacción 1-a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 18, 52 y 59 en presencia de

i) una polimerasa de ácido nucleico

ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1

iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 2

iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 7, 8 y 9, marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 18, 52 y 59;

Reacción 2- a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 39, 51, 56 y 66 en presencia de

i) una polimerasa de ácido nucleico

ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1

iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 3

iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 10, 11, 12 y 13 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 39, 51, 56 y 66;

Reacción 3- a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 16, 45 y 58 en presencia de

i) una polimerasa de ácido nucleico

ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1

iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 4

iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 14,15 y 16 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 16,45 y 58;

Reacción 4- a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 31, 33 y 35 en presencia de una polimerasa de ácido nucleico

i) una polimerasa de ácido nucleico

ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1

iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5

iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 17,18 19 y 20 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

v) un control interno y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 31, 33, 35 y un control interno.

Un método para la detección de un tipo de virus del papiloma humano (HPV)

Campo de la invención La presente invención se refiere a la detección, tipificación y cuantificación de virus del papiloma humano (HPV) en muestras clínicas. Más específicamente, se refiere a las secuencias de oligonucleótidos que pueden ser utilizadas en las reacciones de amplificación y que se usan para la detección simultánea, la tipificación y la cuantificación de una pluralidad de genomas de HPV y un kit de diagnóstico de las mismas.

Antecedentes de la invención Las infecciones por el virus del papiloma humano (HPV) se reportaron como una causa de cáncer de cuello uterino en la década de 1980. La relación entre la malignidad del cáncer y el genotipo del HPV fue considerada de interés. Desde entonces se han identificado más de 120 tipos de HPV. Se han identificado como oncogénicos trece tipos de HPV en el epitelio de la mucosa. Estos tipos incluyen el HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 66.

Las infecciones por papilomavirus humano se limitan al epitelio, lo que limita su contacto con el sistema inmune y son poco inmunogénicas. Por lo tanto la serología no es una prueba válida para el HPV. Del mismo modo, el cultivo no es una técnica de diagnóstico válida. Aunque es posible reproducir el ciclo de vida del virus in vitro, esta es una técnica de cultivo de tejidos altamente sofisticada que requiere la diferenciación in vitro de cultivos de células epiteliales. Por otra parte, las neoplasias y los cánceres cervicales de alto grado no producen virus. Por lo tanto, el análisis del HPV se basa en la detección de ácidos nucleicos virales.

El análisis del HPV ha demostrado tener una mayor sensibilidad que el ensayo de PAP (prueba de Papanicolaou) para la displasia cervical de alto grado, aunque su especificidad es menor debido a la alta prevalencia de las infecciones por HPV transitorias benignas.

Muchos países han adoptado el análisis del HPV como una prueba de cribado secundaria (triage) para la displasia de bajo grado y equívoca y también se ha sugerido su uso en el cribado primario.

El prueba del HPV dominante es en la actualidad es la prueba de Digene HCII, cuya utilidad está respaldada por una gran cantidad de literatura científica. En esta prueba el ADN del HPV de la muestra se hibrida con el ARN complementario y los híbridos ADN-ARN resultantes son capturados por los anticuerpos sobre una superficie sólida a la que posteriormente se unen los conjugados anticuerpo-enzima que se detectan por quimioluminiscencia catalizada por enzimas. El ensayo de LCII no distingue entre los diferentes tipos de HPV oncogénicos.

También es posible detectar HPV en las células fijadas utilizando la hibridación in situ con sondas marcadas, ya sea con restos fluorescentes (hibridación fluorescente in-situ, FISH) o con haptenos que se pueden unir a un conjugado enzimático que genera un precipitado coloreado insoluble in situ. La hibridación in situ puede proporcionar información valiosa sobre la ubicación y el estado físico del HPV, pero la detección específica de un tipo de los múltiples tipos de HPV en la misma muestra es impracticable.

Muchas autoridades en detección han expresado su preferencia por las pruebas de genotipado en la detección secundaria ya que estas permiten distinguir las infecciones transitorias recurrentes que son benignas, de las infecciones persistentes de tipo específico que no son benignas. Además, algunos tipos de HPV, particularmente HPV16, tiene marcadamente más virulencia oncogénica.

Por último, el uso de una prueba de genotipado proporciona información epidemiológica válida que será de especial valor en el seguimiento de los efectos de la vacunación contra el HPV 16 y HPV 18 en la población.

Las pruebas de genotipado de HPV disponibles se basan principalmente en una PCR seguida de una hibridación inversa en algún formato. La etapa de PCR se dirige a los genes L1 o E1. Los amplicones de PCR se marcan mediante amplificación e hibridan con las sondas inmovilizadas sobre una micromatriz, en una tira de membrana o en los pocillos de una placa de microtitulación. A continuación, se detecta el amplicón marcado unido, ya sea directamente por fluorimetría si el amplicón está marcado con un resto fluorescente o utilizando conjugados enzimáticos que se unen al marcador y que son detectados usando técnicas colorimétricas o luminométricas. Estas pruebas implican la manipulación de los amplicones de PCR en el laboratorio abierto lo que requiere unas precauciones higiénicas estrictas. Esto, combinado con el alto precio de estas pruebas sitúa las pruebas disponibles fuera del alcance de la mayoría de los programas de cribado masivo. También está disponible una prueba de genotipado que detecta ARNm de los oncogenes virales E6 y E7 utilizando SDA (amplificación dependiente de secuencia) . Sin embargo, este método detecta sólo cinco de los trece tipos oncogénicos y sólo cuando hay expresión de un oncogén activo.

La solicitud de patente WO 2007115582 A1 describe los conjuntos de cebadores y sondas de PCR para la detección de múltiples tipos de HPV mediante PCR en tiempo real. Estos conjuntos involucran a una combinación de cebadores compleja. En el método de acuerdo con la presente invención, sólo se requieren un cebador directo y

cuatro cebadores reversos. Esto simplifica el control de calidad y la fabricación y reduce el coste. Además, los genes diana de la solicitud de patente WO 2007115582 A1 están sujetos a las variaciones de secuencias intratípicas. Esta variación no se tiene en consideración. Por lo tanto pueden obtenerse resultados falsos negativos en las muestras clínicas que contengan variantes de la secuencia HPV distintas de las secuencias prototipo. Según la presente invención para el diseño del cebador y de la sonda se ha tenido en cuenta las variaciones de la secuencia conocida dentro de la región diana del gen L1 y todas las posiciones variables se evitan o se tienen en cuenta para la modificación de las secuencias de cebadores.

Además, en el documento WO 2007115582 A1 se indica que se obtienen sensibilidades por debajo de 100 copias para todos los tipos de HPV específicos. Sin embargo, los experimentos descritos no incluyen el uso del ADN portador. Esto proporciona una estimación irrealmente optimista de la sensibilidad puesto que el ADN humano presente en las muestras clínicas reduce la sensibilidad de la PCR. La sensibilidad del método según la presente invención se mide en presencia de 500 ng de ADN humano, que corresponden a 7, 5x104 células humanas y, por tanto imita con precisión las condiciones de una muestra clínica rica en células. Así, la presente invención proporciona mayor sensibilidad en condiciones realistas.

Además, el documento WO 2007115582 A1 describe el uso de una prueba de PCR multiplex 13-plex en un único tubo. Sin embargo, de acuerdo con el estado de la técnica no parece que haya un instrumental capaz de realizar una prueba de este tipo. El método de acuerdo con la presente invención puede realizarse con el instrumental existente que se pueden adquirir en el formato propuesto o una variante o un análogo del mismo.

Además, "Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridation", Journal of Virological Methods, vol. 140, nº 1-2, Marzo 2007, páginas 32-42, describe los cebadores y las sondas para la detección de los tipos de HPV en una muestra biológica. Esta tipificación sin embargo se lleva a cabo mediante hibridación en fase sólida de las sondas.

En el documento WO 2009011472 A1 el gen diana que ha sido utilizado para los ensayos de PCR es E1. Sin embargo, este gen es un punto caliente para las deleciones y las inserciones durante el desarrollo del cáncer. La probabilidad de un resultado falso negativo aumenta de este modo con la gravedad de la enfermedad. El método de acuerdo con la presente invención se dirige al gen L1, que es mucho menos propenso a la deleción.

Además, en el documento WO 2009011472 A1 los métodos para la detección y tipificación del HPV implican la manipulación de los productos de PCR en el laboratorio abierto. Esto implica el riesgo de contaminación de arrastre. El método de acuerdo con la presente invención se realiza en un sistema cerrado que elimina este riesgo, garantizando así resultados más fiables y eliminando el trabajo extra que se requiere para la descontaminación de equipos e instalaciones después del trabajo post-PCR en laboratorio abierto.

Sobre la base de lo anterior, hay una necesidad en este campo de métodos nuevos, cebadores, sondas y kits para la detección y tipificación de HPV que sean... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar y/o tipificar y/o cuantificar simultáneamente la presencia de HPV 18, 52, 59, 39, 51, 56, 66, 16, 45, 58, 31, 33 y 35 en una muestra biológica, comprendiendo el método las siguientes cuatro reacciones paralelas:

Reacción 1-a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 18, 52 y 59 en presencia de i) una polimerasa de ácido nucleico ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 2 iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 7, 8 y 9, marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 18, 52 y 59;

Reacción 2-a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 39, 51, 56 y 66 en presencia de i) una polimerasa de ácido nucleico ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 3 iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 10, 11, 12 y 13 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de 20 HPV 39, 51, 56 y 66;

Reacción 3-a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 16, 45 y 58 en presencia de i) una polimerasa de ácido nucleico ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 4

iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 14, 15 y 16 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 16, 45 y 58;

Reacción 4-a) amplificación de los fragmentos de ácido nucleico de HPV 31, 33 y 35 en presencia de una polimerasa de ácido nucleico i) una polimerasa de ácido nucleico ii) un cebador directo de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 iii) un cebador reverso de PCR con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 iv) una sonda con una secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO: 17, 18 19 y 20 marcada con un fluoróforo y una molécula inhibidora de fluorescencia y v) un control interno y

b) detección de un cambio de fluorescencia cuya longitud de onda del mismo que determina el tipo de HPV 31, 33, 35 y un control interno 2. Un método según la reivindicación 1, en donde dichas reacciones se llevan a cabo en paralelo y en viales 40 separados.

3. Un método según las reivindicaciones 1-2, en donde los cuatro fluoróforos son FAM, VIC, NED y ROX.

4. Un método según las reivindicaciones 1-2, en donde el control interno es HPV6.

5. Un kit para la detección simultánea y/o tipificación y/o cuantificación de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,

52, 56, 58, 59 y 66 en una muestra biológica que comprende las cuatro combinaciones cebador-sonda tal como se 45 utilizan en la reivindicación 1.