Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo.

Un método para tratar material celulósico con celobiohidrolasa,

endoglucanasa, y beta-glucosidasa, por medio del cual dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión que comprende una región núcleo de celobiohidrolasa anclada a un dominio de unión a celulosa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30, y en donde dicha región núcleo tiene una identidad de al menos 95% con el SEQ ID NO: 2.

Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de productos hidrolizados de azúcares a partir de material celulósico. Más precisamente, la invención se refiere a la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico mediante conversión enzimática. Los azúcares fermentables son útiles p. ej. en la producción de bioetanol, o para otros fines. En particular, la invención se refiere a un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa, y a preparaciones de enzimas y usos de las mismas. Se describen nuevos polipéptidos celulolíticos, los polinucleótidos que los codifican, y vectores y células anfitrionas que contienen los polinucleótidos. Adicionalmente, se describen otros usos de los polipéptidos y un método para prepararlos.

Antecedentes de la invención Los productos hidrolizados de azúcares se pueden utilizar para la producción microbiana de una variedad de productos químicos finos o biopolímeros, tales como ácidos orgánicos, p. ej. ácido láctico, o etanol u otros alcoholes,

p. ej. n-butanol, 1, 3-propanodiol, o polihidroxialcanoatos (PHA) . Los productos hidrolizados de azúcar también pueden servir como materia prima para otros procesos no microbianos, p. ej., para el enriquecimiento, aislamiento y purificación de azúcares de alto valor o varios procesos de polimerización. Uno de los principales usos de los productos hidrolizados de azúcares es en la producción de biocarburantes. La producción de bioetanol y/u otros productos químicos puede tener lugar en un proceso integrado en una biorrefinería (Wyman 2001) .

Los recursos limitados de carburantes fósiles, y cantidades crecientes de CO2 liberado a partir de los mismos y causantes el fenómeno del efecto invernadero han planteado la necesidad de la utilización de la biomasa como fuente de energía renovable y limpia. Una tecnología prometedora alternativa es la producción de biocarburantes, es decir, etanol a partir de materiales celulósicos. En el sector del transporte los biocarburantes son, por el momento la única opción, que podría reducir las emisiones de CO2 en un orden de magnitud. Se puede utilizar el etanol en vehículos y sistemas de distribución existentes y por lo tanto no se requiere inversiones costosas en infraestructuras. Los azúcares derivados de materias primas renovables lignocelulósicas también se pueden utilizar como materias primas para una variedad de productos químicos que pueden reemplazar los productos químicos con una base oleosa.

La mayoría de los carbohidratos en las plantas están en la forma de lignocelulosa, que consiste esencialmente en celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. En un procedimiento de lignocelulosa a etanol el material lignocelulósico se pretrata en primer lugar químicamente o físicamente para hacer más accesible a la hidrólisis la fracción de celulosa. La fracción de celulosa se hidroliza a continuación para obtener azúcares que pueden ser fermentados por levadura a etanol. La lignina se obtiene como un co-producto principal que se puede utilizar como carburante sólido.

Los costes de producción de bioetanol son altos y la producción de energía es baja, y existe una continua búsqueda para hacer el proceso más económico. La hidrólisis enzimática se considera la tecnología más prometedora para la conversión de biomasa celulósica en azúcares fermentables. Sin embargo, la hidrólisis enzimática se utiliza solamente a una cantidad limitada a escala industrial, y especialmente cuando se utiliza material fuertemente lignificado tal como madera o residuos agrícolas, la tecnología no es satisfactoria. El coste de la etapa enzimática es uno de los principales factores económicos del procedimiento. Se han realizado esfuerzos para mejorar la eficacia de la hidrólisis enzimática del material celulósico (Badger 2002) .

El documento US 2002/0192774 A1 describe un procedimiento continuo para la conversión de biomasa lignocelulósica sólida en productos carburantes combustibles. Después del pretratamiento mediante oxidación húmeda o explosión de vapor la biomasa se separa parcialmente en celulosa, hemicelulosa y lignina, y a continuación se somete a hidrólisis parcial utilizando una o más enzimas carbohidrasas (CE 3.2) . Se proporciona como ejemplo Celluclast™, un producto comercial de Novo Nordisk A/S que contiene actividades celulasa y xilanasa.

El documento US 2004/0005674 A1 describe nuevas mezclas de enzimas que se pueden utilizar directamente sobre un sustrato de lignocelulosa, por medio de las cuales se pueden evitar los productos de desecho tóxicos formados durante los procedimientos de pretratamiento, y se puede ahorrar energía. La mezcla de enzimas sinérgicas contiene una celulasa y una enzima auxiliar tal como celulasa, xilanasa, ligninasa, amilasa, proteasa, lipidasa o glucuronidasa, o cualquier combinación de las mismas. Se considera que la celulasa incluye endoglucanasa (EG) , beta-glucosidasa (BG) y celobiohidrolasa (CBH) . Los ejemplos ilustran el uso de una mezcla de preparaciones de xilanasa y celulasa de Trichoderma.

Kurabi et al. (2005) han investigado la hidrólisis enzimática de abeto de Douglas por explosión de vapor y pretratadomediante organosolv con etanol por medio de celulasas fúngicas novedosas y comerciales. Éstos sometieron a 2 5

ensayo dos preparaciones de celulasa comerciales de Trichoderna reesei, y dos preparaciones novedosas producidas por cepas mutantes de Trichoderma sp. y Penicillium sp. La preparación de Trichoderma sp. mostró un rendimiento significativamente mejor que las otras preparaciones. Se creyó que el mejor rendimiento se debía al menos en parte a una actividad beta-glucosidasa significativamente mayor, que alivia la inhibición por producto de celobiohidrolasa y endoglucanasa.

El documento US 2004/0053373 A1 se refiere un método de conversión de celulosa en glucosa mediante tratamiento de un sustrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende celulasa y una celobiohidrolasa I (CBHI) modificada. La CBHI ha sido modificada inactivando su dominio de unión a celulosa (CBD) . Las ventajas de la modificación de CBHI son, p. ej. una mejor recuperación y una mayor tasa de hidrólisis con alta concentración de sustrato. La celulasa se selecciona del grupo que consiste en EG, CBH y BG. La CBHI se obtiene preferiblemente a partir de Trichoderma.

El documento US 2005/0164355 A1 describe un método para degradar material lignocelulósico con una o más enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo. También se pueden usar enzimas adicionales tales como hemicelulasas, esterasa, peroxidasa, proteasa, lacasa o una mezcla de las mismas. La presencia de agente tensioactivo aumenta la degradación de material lignocelulósico en comparación con la ausencia de tensioactivo. Las enzimas celulolíticas pueden ser cualquier enzima implicada en la degradación de lignocelulosa incluyendo CBH, EG y BG.

Existe un gran número de publicaciones que describen diversas celulasas y hemicelulasas.

Se describen celobiohidrolasas (CBHS) p. ej., en el documento WO 03/000941, que se refiere a enzimas CBHI obtenidas a partir de diversos hongos. No se proporcionan las propiedades fisiológicas de las enzimas, ni ningún ejemplo de sus usos. Hong et al. (2003b) caracteriza CBHI de Thermoascus aurantiacus producida en levadura. No se describen las aplicaciones de la enzima. Tuohy et al. (2002) describen tres formas de celobiohidrolasas de Talaromyces emersonii.

Se describen las endoglucanasas de la familia cel5 (EG fam 5) p. ej., en el documento WO 03/062409, que se refiere a composiciones que comprenden al menos dos enzimas termoestables para su uso en aplicaciones para forraje. Hong et al. (2003a) describen la producción de endo-β-1, 4-glucanasa termoestable a partir de T. aurantiacus en levadura. No se explican las aplicaciones. El documento WO 01/70998 se refiere a β-glucanasas de Talaromyces. También describe β-glucanasas de Talaromyces emersonii. Se comentan las aplicaciones para alimentos, forrajes, bebidas, elaboración de la cerveza, y detergentes. No se menciona la hidrólisis de lignocelulosa. El documento WO 98/06858 describe beta-1, 4-endoglucanasa de Aspergillus niger y comenta las aplicaciones para forraje y alimento de la enzima. El documento WO 97/13853 describe métodos para el escrutinio de fragmentos de ADN que codifican enzimas en genotecas de ADNc. La genoteca de ADNc es de origen de levadura o fúngico, preferiblemente de Aspergillus. La enzima es preferiblemente una celulasa. Van Petegem et al. (2002) describen la... [Seguir leyendo]

1. Un método para tratar material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, y beta-glucosidasa, por medio del cual dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión que comprende una región núcleo de celobiohidrolasa anclada a un dominio de unión a celulosa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30, y en donde dicha región núcleo tiene una identidad de al menos 95% con el SEQ ID NO: 2.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o con un fragmento del mismo que tiene actividad endoglucanasa.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la beta-glucosidasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o con un fragmento del mismo que tiene actividad beta-glucosidasa.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la beta-glucosidasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material celulósico es material lignocelulósico.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tratar material lignocelulósico con al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 18 o 20, o con un fragmento del mismo que tiene actividad xilanasa.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la xilanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus o Acremonium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, o Acremonium thermophilum CBS 116240.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las enzimas se añaden al material celulósico o bien simultáneamente o bien sucesivamente.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos una de las enzimas está codificada por un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el material celulósico se selecciona del grupo que consiste en rastrojo de maíz, pasto varilla, paja de cereales, bagazo de caña de azúcar y materiales derivados de madera.

13. Una preparación de enzima que comprende celobiohidrolasa, endoglucanasa, y beta-glucosidasa, en donde dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión que comprende una región núcleo de celobiohidrolasa anclada a un dominio de unión a celulosa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30, y en donde dicha región núcleo tiene una identidad de al menos 95% con el SEQ ID NO:

2.

14. La preparación de enzima de la reivindicación 13, en donde la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o con un fragmento del mismo que tiene actividad endoglucanasa.

15. La preparación de enzima de la reivindicación 14, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.

16. La preparación de enzima de la reivindicación 13, en donde la beta-glucosidasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o con un fragmento del mismo que tiene actividad beta-glucosidasa.

17. La preparación de enzima de la reivindicación 16, en donde la beta-glucosidasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.

18. La preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, que comprende al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 18 o 20, o con un fragmento del mismo que tiene actividad xilanasa.

19. La preparación de enzima de la reivindicación 18, en donde la xilanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus o Acremonium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239 o Acremonium thermophilum CBS 116240.

20. La preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en donde al menos una de las enzimas está codificada por un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 10 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.

21. La preparación de enzima de la reivindicación 13, que está en forma de medio de cultivo gastado, o polvos, gránulos, o líquido.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la preparación de enzima de una cualquiera de las

reivindicaciones 13-21, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el SEQ 15 ID NO: 28 o el SEQ ID NO: 30.

23. El uso de una preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-22 para la degradación de material celulósico.

24. El uso de la reivindicación 23, en donde el material celulósico se selecciona del grupo que consiste en rastrojo de maíz, pasto varilla, paja de cereales, bagazo de caña de azúcar y materiales derivados de madera.

25. El uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o 22 en un procedimiento para preparar etanol a partir de material celulósico.