Sistema para la expresión de genes en plantas.

Un método para expresar un polinucleótido de interés en una planta que comprende:

(a) introducir un vector vehicular y vector productor en una planta, en el que:

(i) el vector vehicular incluye un primer polinucleótido de interés y el vector productor incluye un segundo polinucleótido de interés;

(ii) el vector productor incluye un primer componente necesario para la expresión sistémica del primer polinucleótido de interés, y el vector vehicular carece del primer componente;

(iii) el vector vehicular incluye un segundo componente necesario para la expresión sistémica del segundo polinucleótido de interés, y el vector productor carece del segundo componente; y

(iv) el primer y segundo componentes se seleccionan del grupo que consiste en un componente de proteína de cubierta funcional, un componente de replicasa funcional, y un componente de proteína de movimiento funcional, en el que el primer y segundo componentes se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: componentes de Bromoviridae y componentes de Tobamoviridae;

(b) mantener la planta en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que el vector vehicular complemente el vector productor, y que el vector productor complemente el vector vehicular de manera que tanto el vector vehicular como el vector productor se muevan sistémicamente en la planta, y

(c) mantener la planta en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el primer y segundo polinucleótidos de interés se expresen en al menos algunas células de la planta.

Sistema para la expresión de genes en plantas Antecedentes de la invención

En los últimos años, las plantas se han utilizado cada vez más como un sistema huésped para la expresión de proteínas recombinantes. Dicha expresión puede lograrse bien integrando el gen de interés en el genoma de una planta, para crear una planta transgénica que expresa de forma estable la protema deseada, o introduciendo el gen de interés en un vector de planta que se puede introducir en, y mantener de forma transitoria en, las células de plantas. Los sistemas de vectores virales han demostrado ser particularmente útiles. Yusibov et al ("Expression in plants and ¡mmunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine", Vaccine 20 (2002) 3155-3164) describe un sistema con un vector del virus del mosaico del tabaco (TMV) en el cual la proteína de la cubierta (CP) de TMV se reemplaza por CP del virus del mosaico de la alfalfa (AIMV), con una fusión del epítopo del virus de la rabia a la CP de AIMV. WO 00/46350 describe el uso de plantas transgénicas para replicasa para expresar polipéptidos así como composiciones que comprenden vectores virales recombinantes capaces de infección sistémica para producir polipéptidos extraños en una planta huésped. Mori et al ("Inducible high-level mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plant", The Plant Journal (2001) 27(1), 79-86) describen un sistema de amplificación con plantas transgénicas que tienen componentes del virus del mosaico bromo. La amplificación de los ARNm está regulada por la expresión de una subunidad de la replicasa BMV. Bendahmane et al ("Characterization of mutant tobáceo mosaic virus coat protein that ¡nterferes with virus cell-to-cell movement", PNAS (2002) 99(6), 3645-3650) describen un TMV con una CP mutante y derivados con fusiones GFP a CP o proteína de movimiento (MP). Sanchez-Navarro et al ("Engineering of Alfalfa mosaic virus RNA 3 into an expression vector", Arch Virol (2001) 146: 923-939) describen el uso de ARN 3 de AIMV como un vector para la expresión de GFP en plantas de Nicotina tabaccum que expresan las proteínas polimerasa virales P1 y P2. Spitsin et al ("Expression of alfalfa mosaic virus coat protein in tobáceo mosaic virus (TMV) deficient in the production of its native coat protein supports long-distance movement of a chimeric TMV», PNAS (1999) 96 2549-2553) describen la extensión del rango de huéspedes de TMV mediante la incorporación de determinantes genéticos de otro virus. Se produjo un híbrido que contenía TMV y la CP de AIMV.

Sin embargo, permanece una necesidad de desarrollar sistemas mejorados para expresar transgenes en plantas. Por ejemplo, una desventaja con los actuales sistemas de vectores virales es que los virus pueden infectar plantas no diana, presentando potencialmente riesgos medioambientales significativos. Además, muchos virus de plantas preparados por ingeniería disponibles no expresan transgenes a niveles deseados, y/o en las plantas o tejidos diana deseados. La presente invención aborda muchos de estos problemas, y otros.

Resumen de la invención

La presente invención engloba el reconocimiento de que existe una necesidad de desarrollar sistemas de expresión para plantas que presentan sólo un riesgo mínimo de contaminación medioambiental. La invención proporciona métodos y reactivos para la expresión de productos polinucleotídicos y polipeptídicos en plantas con un riesgo reducido de contaminación extendida.

Por ejemplo, en un aspecto, describimos conjuntos de vectores de expresión viral, cada uno de los cuales es incapaz de establecer una infección sistémica por sí mismo, pero que conjuntamente permiten la infección sistémica. La complementación cruzada (también referida como trans-complementación) por los vectores permite que una infección local inicial (por ejemplo, establecida por inoculación) se mueva a hojas no inoculadas y se establezca una infección sistémica.

En realizaciones específicas, la invención proporciona un kit que incluye un vector productor que incluye un polinucleótido de interés pero que carece de versiones funcionales de uno o más genes necesarios para el movimiento a larga distancia, junto con un vector vehicular que proporciona una secuencia codificadora de una proteína de movimiento a larga distancia funcional. Por ejemplo, la invención proporciona un kit para expresar un polinucleótido de interés en una célula de planta o planta completa, que comprende: (i) un vector vehicular que incluye un componente que codifica una proteína de cubierta de un primer virus de planta; y (ii) un vector productor que incluye un polinucleótido de interés, e incluye además al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un gen de proteína de cubierta funcional. La invención proporciona además un kit para expresar un polinucleótido de interés en una célula de planta o planta completa, que comprende: (i) un vector vehicular que incluye un componente que codifica una proteína de movimiento de un primer virus de planta; y (ii) un vector productor que incluye un polinucleótido de interés, e incluye además al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un gen de proteína de movimiento funcional.

En determinadas realizaciones de la invención el vector vehicular es defectuoso para la replicación. Por ejemplo, el vector productor puede incluir una gen de replicasa (por ejemplo, un gen de ARN polimerasa) y un gen de proteína de movimiento (de manera que el vector es competente para el movimiento célula a célula), pero puede carecer de un gen de proteína de cubierta (de manera que el vector no es competente para el movimiento a larga distancia (sistémico)). El vector vehicular puede incluir un gen de proteína de cubierta (de manera que el vector es competente

para el movimiento a larga distancia), pero puede carecer de un gen de replicasa (de manera que el vector es incapaz de auto-replicarse) Alternativamente, el vector vehicular podría incluir un gen de replicasa (de manera que el vector es competente para la replicación), y podría usarse con un vector productor que carece tanto de capacidad de replicación como de movimiento a larga distancia. Los vectores preferidos son vectores virales.

También describimos una variedad de vectores que pueden usarse como componentes del o de los sistemas inventivos o para otros propósitos. Por ejemplo, un vector que comprende: (a) uno o más componentes de un primer virus de planta; y (b) una región 3 no traducida parcial o completa de un ARN de un segundo virus de planta. En determinadas realizaciones, la región 3 no traducida facilita la diseminación sistémica del virus. La región 3 no traducida puede comprender un sitio de reconocimiento para la formación de un complejo con la proteína de cubierta.

En otros aspectos, la invención también proporciona una variedad de métodos para expresar polinucleótidos en plantas, por ejemplo, usando los vectores y los sistemas descritos en la presente memoria.

Una ventaja del sistema descrito en la presente memoria para expresar polinucleótidos en plantas es que reduce o elimina el riesgo de que los vectores, particularmente los vectores recombinantes que comprenden el o los polinucleótidos que se van a expresar, se diseminen a plantas no diana, mejorando de esta manera significativamente la seguridad medioambiental de la expresión génica en plantas y permitiendo más flexibilidad en el cultivo de las plantas receptoras.

Otra ventaja asociada con la presente invención es que permite al investigador diseñar un sistema de expresión en plantas con cualidades de más de un virus de planta. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la invención, el vector productor tiene de manera deseable el polinucleótido de interés posicionado de manera que su expresión está controlada por el promotor de la proteína de cubierta ("CP"). En muchos casos, por lo tanto, será deseable basar el vector productor en un sistema viral con un fuerte promotor de CP. Sin embargo, los virus con fuertes promotores de CP a veces tienen una limitada especificidad del huésped, por ejemplo, pueden ser incapaces de replicarse y/o conseguir movimiento de célula a célula o movimiento sistémico en determinadas plantas huésped. Puede ser deseable, por lo tanto, basar el vector vehicular en un sistema viral con una especificidad del huésped amplia, de manera que la característica de alta expresión del sistema viral del cual deriva el vector productor pueda ser explotada en un huésped que normalmente es inaccesible para ese sistema viral.

Esta solicitud se refiere a varias patentes, solicitudes de patente, y publicaciones. Los contenidos de todas éstas se incorporan en la presente memoria por referencia. Además,... [Seguir leyendo]

1. Un método para expresar un polinucleótido de interés en una planta que comprende:

(a) introducir un vector vehicular y vector productor en una planta, en el que:

(i) el vector vehicular incluye un primer polinucleótido de interés y el vector productor incluye un segundo polinucleótido de interés;

(ii) el vector productor incluye un primer componente necesario para la expresión sistémica del primer polinucleótido de interés, y el vector vehicular carece del primer componente;

(iii) el vector vehicular incluye un segundo componente necesario para la expresión sistémica del segundo polinucleótido de interés, y el vector productor carece del segundo componente; y

(iv) el primer y segundo componentes se seleccionan del grupo que consiste en un componente de proteína de cubierta funcional, un componente de replicasa funcional, y un componente de proteína de movimiento funcional, en el que el primer y segundo componentes se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: componentes de Bromoviridae y componentes de Tobamoviridae;

(b) mantener la planta en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que el vector vehicular complemente el vector productor, y que el vector productor complemente el vector vehicular de manera que tanto el vector vehicular como el vector productor se muevan sistémicamente en la planta, y

(c) mantener la planta en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el primer y segundo polinucleótidos de interés se expresen en al menos algunas células de la planta.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que:

a) el vector vehicular incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional, o

b) el vector vehicular incluye un componente de replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector

productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de

replicasa funcional, o

c) el vector vehicular incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional, o

d) el vector productor incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional, o

e) el vector productor incluye un componente de replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector

vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de

replicasa funcional, o

f) el vector productor incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector vehicular incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional.

4. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector vehicular incluye un componente de replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de replicasa funcional.

5. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector vehicular incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional.

6. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector productor incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional.

7. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector productor incluye un componente de replicasa funcional

de un primer virus de planta, y el vector vehicular Incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de replicasa funcional.

8. Un método según la reivindicación 2, en el que el vector productor incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que el primer y segundo virus de planta son el mismo virus.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que el primer y segundo virus de planta son virus diferentes.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, en el que cada uno del primer y segundo virus de planta se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un bromovirus y un tobamovlrus, y en el que el bromovlrus es un alfamovirus, un virus del mosaico de la alfalfa o un ilarvirus y el tobamovirus es un virus del mosaico del tabaco.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que cada uno del primer y segundo polinucleótidos de interés se selecciona independientemente del grupo que consiste en polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas, polinucleótidos que codifican una o más cadenas de anticuerpo, polinucleótidos que codifican proteínas nutricionalmente relevantes, y polinucleótidos que proporcionan un molde para la transcripción de una especie de ARN activa.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en el que el al menos un componente de un segundo virus de planta comprende una parte no codificadora del genoma del segundo virus de planta.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la parte no codificadora comprende una reglón no traducida 5' ó 3' de un ARN viral.

15. Un kit para expresar polinucleótidos de interés en una célula de planta o planta completa, comprendiendo el kit un vector vehicular y un vector productor, en el que:

(I) el vector vehicular Incluye un primer polinucleótido de interés y el vector productor incluye un segundo polinucleótido de Interés;

(¡i) el vector productor incluye un primer componente necesario para la expresión sistémica del primer polinucleótido de Interés, y el vector vehicular carece del primer componente;

(iii) el vector vehicular incluye un segundo componente necesario para la expresión sistémica del segundo polinucleótido de interés, y el vector productor carece del segundo componente; y

(iv) el primer y segundo componentes se seleccionan del grupo que consiste en un componente de proteína de cubierta funcional, un componente de replicasa funcional, y un componente de proteína de movimiento funcional.

16. Un kit según la reivindicación 15, en el que:

el vector vehicular incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional, o el vector vehicular incluye un componente de proteína replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína replicasa funcional, o

el vector vehicular incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional, o

el vector productor incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional; o el vector productor incluye un componente de replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de replicasa funcional, o el vector productor incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional.

17. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector vehicular incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional.

18. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector vehicular incluye un componente de replicasa funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de replicasa funcional.

19. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector vehicular incluye un componente de proteína de movimiento 5 funcional de un primer virus de planta, y el vector productor incluye al menos un componente de un segundo virus de

planta, pero carece de un componente de protema de movimiento funcional.

20. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector productor Incluye un componente de proteína de cubierta funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de proteína de cubierta funcional.

21. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector productor Incluye un componente de replicasa funcional de

un primer virus de planta, y el vector vehicular Incluye al menos un componente de un segundo virus de planta, pero carece de un componente de replicasa funcional.

22. Un kit según la reivindicación 16, en el que el vector productor Incluye un componente de proteína de movimiento funcional de un primer virus de planta, y el vector vehicular incluye al menos un componente de un segundo virus de 15 planta, pero carece de un componente de proteína de movimiento funcional.