Separación de proteínas plasmáticas.

Procedimiento de separación de proteínas fibrinógeno, Factor XIII y cola biológica de una fracción plasmática solubilizada,

a base de fibrinógeno y Factor XIII, y de preparación de concentrados liofilizados de dichas proteínas que comprende las etapas de:

a) purificación por cromatografía que comprende las etapas de:

i) carga de un intercambiador de aniones de tipo débilmente básico en dicha fracción solubilizada, previamente equilibrada con un tampón de fuerza iónica predeterminada de pH básico, lo que permite retener la cola biológica,

ii) elución de la cola biológica aumentando la fuerza iónica de dicho tampón,

b) separación del Factor XIII a partir del fibrinógeno mediante la adición de al menos un agente químico precipitante del Factor XIII en al menos una parte del eluato de cola biológica, y recuperación de la solución resultante de sobrenadante de fibrinógeno purificado, y

c) diafiltración de las soluciones de fibrinógeno, de cola biológica y de FXIII puestas de nuevo en solución, seguida de una liofilización de dichas soluciones.

Separación de proteínas plasmáticas

La presente invención se refiere a un procedimiento de separación de proteínas fibrinógeno, Factor XIII y cola biológica y de preparación de concentrados liofilizados de dichas proteínas, altamente purificados y también se refiere a dichos concentrados liofilizados susceptibles de obtenerse mediante el procedimiento.

El fibrinógeno es una proteína esencial de la coagulación sanguínea, ya que su polimerización en fibrina insoluble formada al final de la cascada de reacciones que controlan la coagulación, tiene como resultado la formación de un coágulo que obtura la lesión vascular, responsable del sangrado. De esta manera, la colocación del coágulo es esencial para garantizar que se detiene el sangrado. Además, la fibrina formada a nivel de la herida constituye una red fibrilar que garantiza la reparación tisular (cicatrización).

Las deficiencias congénitas en fibrinógeno pueden conducir a graves patologías. Para curar estas deficiencias, es necesario disponer de concentrados de fibrinógeno que puedan administrarse a los pacientes en tratamiento. También pueden curarse otras patologías mediante la administración de fibrinógeno, en particular en el caso de pérdidas masivas de sangre (cirugía, traumatismos, etc.), o a consecuencia de una coagulopatía de consumo descompensada (CID).

Por otra parte, las colas biológicas activables por la trombina que contienen fibrinógeno, como constituyente mayoritario, y Factor XIII (FXIII), se utilizan eficazmente para la reparación tisular en usos clínicos, tales como los injertos de piel, las suturas nerviosas o arteriales, como se describe, por ejemplo, en las patentes EP 0 305 243, FR 2 448 900 y FR 2 448 901. La presencia de Factor XIII o de transglutaminasa en estos productos contribuye a la estabilización de la fibrina mediante la creación de enlaces covalentes intercatenarios lo que la vuelve insoluble. En algunos casos, estos productos se obtienen de acuerdo con procedimientos de producción de fibrinógeno bastante complejos que requieren de un aporte exógeno de Factor XIII purificado para poder cumplir su función terapéutica.

Por consiguiente, disponer de concentrados de fibrinógeno, de colas biológicas, y de Factor XIII, en particular con fines terapéuticos, requiere técnicas de purificación que conducen a productos no solamente suficientemente purificados de contaminantes de diversa naturaleza, tales como proteínas acompañantes o coprecipitadas, anticuerpos o proteasa, si no también de mayor seguridad en el plano viral.

El aislamiento de fracciones enriquecidas en fibrinógeno, que contienen, dado el caso, FXIII, a partir de plasma ya se conoce y fue descrito inicialmente en los trabajos de Cohn y Nitschmann (Cohn et al, J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 y Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Métodos más recientes asocian técnicas de precipitación de diferentes fuentes de plasma y técnicas de filtración, cromatografía, inactivación viral etc. Se pueden citar, como ejemplo, las patentes y solicitudes de las patentes EP 0 359 593, US 5 099 003, EP 0 305 243, FR 2 448 900 y FR 2 448 901.

No obstante, se utilizan cada vez procedimientos diferentes para producir concentrados o composiciones bien de fibrinógeno, como se describe en la solicitud de la patente EP 1 457 497, bien de cola biológica, por ejemplo de acuerdo con la patente EP 0 771 324, o bien enriquecidos de fibrinógeno que contienen otras proteínas acompañantes como FXIII, Factor VIII, fibronectina, factor von Willenbrand etc. (en particular US 6 121 232).

Por lo tanto, estos procedimientos implican cadenas de producción distintas que utilizan, por consiguiente, métodos diferentes de obtención de las proteínas correspondientes empleando cada vez varias fuentes de materia prima. Además, pueden implicar, de acuerdo con el caso, costosos soportes cromatográficos, tales como los geles de afinidad a base de metal quelato (WO 2004/007533), susceptibles no obstante de liberar en los eluatos metales residuales, que pueden provocar reacciones indeseadas con las proteínas (por ejemplo oxidación). Esto plantea un problema de comodidad en la utilización a escala industrial cuando las necesidades conjuntas de estos tres principios activos se resienten. Estos problemas se acentúan aún más cuando las diferentes proteínas obtenidas de esta manera deben tratarse para inactivar y/o eliminar virus y otros contaminantes indeseados, como el prión.

A este respecto, algunos tratamientos de inactivación viral clásicos que consisten en un tratamiento térmico, tal como la pasteurización a 60 2C durante 20 h en presencia de estabilizantes protectores, y un tratamiento químico, tal como por solvente-detergente, cuyo objetivo es hacer compatibles los concentrados anteriormente citados con el uso terapéutico, no permiten inactivar completamente los virus, en particular los virus sin envoltura (parvovirus B19, hepatitis A y B etc.).

Para remediar este inconveniente, normalmente se recurre a métodos de inactivación viral más eficaces, tales como el calentamiento en seco en condiciones severas (80 2C, 72 h). Esta etapa requiere de la incorporación de una formulación estabilizante adecuada que ofrezca condiciones tales como, por ejemplo, la estabilización del fibrinógeno durante esta etapa, mientras que se destruyen los virus. Tal formulación ha sido objeto de una solicitud de patente FR 04 02001 depositada por la solicitante. Ahora bien, esta formulación se aplica a la estabilización de una proteína definida y no de las proteínas acompañantes, cuyas características son diferentes a las del fibrinógeno.

Las técnicas de filtración, en particular la nanofiltración que utiliza filtros de una porosidad de 35 nm, incluso inferior, también se utilizan para la eliminación viral. Sin embargo, esta técnica no puede utilizarse eficazmente sin conocer los parámetros físico-químicos que influyen en el rendimiento de recuperación de los compuestos a filtrar, y esto evitando la colmatación del filtro y el paso de diversos virus y contaminantes. Estos parámetros, tales como la fuerza iónica, el pH de la solución, así como las condiciones operativas de la filtración, imponen condiciones específicas de utilización que también dependen de la naturaleza del compuesto o compuestos presentes en la solución a filtrar. Aunque las solicitudes de las patentes EP 1 348 445 A1, EP 1 161 958 A1 y WO 99/23111 divulguen la casi total eliminación de los virus sin envoltura de muy pequeño tamaño presentes en las soluciones de proteínas, tales como los de la hepatitis A, mediante nanofiltración con filtros de 15 nm, todavía queda un riesgo de transmisión de virus indeseables o de priones.

Para remediar este riesgo, se puede realizar una doble, incluso triple, inactivación y/o eliminación viral asociando al menos dos técnicas cualesquiera de las mencionadas anteriormente, como se describe por ejemplo en la solicitud de la patente WO 2004/007533. Cuando se asocian estos tratamientos, es indispensable seleccionar, en función del método de inactivación viral, excipientes virucidas y/o estabilizantes protectores que no tengan simultáneamente una acción nefasta por ejemplo sobre los parámetros físico-químicos anteriormente citados que rigen la nanofiltración.

La solicitante pretende por lo tanto realizar un procedimiento de separación de fibrinógeno, de Factor XIII y de cola biológica activable por la trombina que responde a un doble objetivo. Por una parte, disponer de un único procedimiento que permita obtener conjuntamente concentrados de estas proteínas liofilizadas y altamente purificadas, a partir de una única materia prima plasmática que contiene fibrinógeno y Factor XIII, y por otra parte que este procedimiento sea compatible con al menos un tratamiento de inactivación y/o eliminación de virus y otros contaminantes indeseables (polímeros, agregados, prión).

Por consiguiente, la invención se refiere a un procedimiento de separación de proteínas fibrinógeno, Factor XIII y cola biológica de una fracción plasmática solubilizada, a base de fibrinógeno y Factor XIII, y de preparación de concentrados liofilizados de dichas proteínas que comprende las siguientes etapas:

a) purificación por cromatografía que comprende las etapas de:

i) carga de un intercambiador de aniones de tipo débilmente básico en dicha fracción solubilizada, previamente equilibrada con un tampón de fuerza iónica predeterminada de pH básico, lo que permite retener la cola biológica,

ii) elución de la cola biológica aumentando la fuerza iónica de dicho tampón,

b) separación del Factor XIII a partir del fibrinógeno mediante la adición en al menos una parte del eluato de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de separación de proteínas fibrinógeno, Factor XIII y cola biológica de una fracción plasmática solubilizada, a base de fibrinógeno y Factor XIII, y de preparación de concentrados liofilizados de dichas proteínas que comprende las etapas de:

a) purificación por cromatografía que comprende las etapas de:

i) carga de un intercambiador de aniones de tipo débilmente básico en dicha fracción solubilizada, previamente equilibrada con un tampón de fuerza iónica predeterminada de pH básico, lo que permite retener la cola biológica,

¡I) elución de la cola biológica aumentando la fuerza iónica de dicho tampón,

b) separación del Factor XIII a partir del fibrinógeno mediante la adición de al menos un agente químico precipitante del Factor XIII en al menos una parte del eluato de cola biológica, y recuperación de la solución resultante de sobrenadante de fibrinógeno purificado, y

c) diafiltración de las soluciones de fibrinógeno, de cola biológica y de FXIII puestas de nuevo en solución, seguida de una liofilización de dichas soluciones.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el tampón de equilibrio tiene una fuerza iónica inferior al valor de 0,2 y, de preferencia, se sitúa en el intervalo de valores que van de 0,06 a 0,2.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el pH del tampón de equilibrio se sitúa en el intervalo de valores superiores a 7 hasta 9, de preferencia de 7,5 a 8,2.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende, previamente a la etapa de elución de la cola biológica, una etapa de lavado, con dicho tampón de equilibrio, del intercambiador de aniones hasta la eliminación de las proteínas y los contaminantes no retenidos.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la elución de la cola biológica se realiza con el tampón de equilibrio cuya fuerza iónica está comprendida entre 0,5 y 1,3, en particular entre 0,9 y 1,1, y está a pH comprendido entre 7,4 y 7,6.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el tampón de elución además contiene una mezcla de 10 a 12 g/l de citrato trisódico, de 1 a 5 g/l de lisina, de 1 a 5 g/l de glicina, de 2 a 5 g/l de Tris, de 25 a 50 g/l de arginina y de 5 a 15 g/l de isoleucina.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el agente químico precipitante del Factor XIII está en forma de solución acuosa a base de sales de citrato 1 M.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el precipitado de FXIII se pone de nuevo en solución en agua o en un tampón que contiene una mezcla de 10 a 12 g/l de citrato trisódico, de 1 a 5 g/l de lisina, de 1 a 5 g/l de glicina, de 2 a 5 g/l de Tris, de 25 a 50 g/l de arginina y de 5 a 15 g/l de isoleucina, ajustado a pH comprendido entre 6,9 y 7,1.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la diafiltración se realiza con el tampón definido en la reivindicación 8.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende al menos una etapa de tratamiento de inactivación viral y/o de eliminación de virus y contaminantes, seleccionándose el tratamiento del grupo constituido por el tratamiento químico de inactivación viral, la nanofiltración y el tratamiento térmico de inactivación viral en seco.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el tratamiento químico de inactivación viral se realiza previamente a la etapa a).

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en que el tratamiento químico de inactivación viral consiste en un tratamiento por solvente-detergente realizado por agentes químicos que representan la mezcla de Tween®-TnBP o de tritón-TnBP.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la nanofiltración se realiza con el eluato obtenido mediante la etapa a) o con las soluciones diafiltradas de fibrinógeno, de cola biológica y de FXIII puestos de nuevo en solución, antes de la liofilización.

14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el tratamiento térmico de inactivación viral en seco se realiza con los liofilizados de fibrinógeno, de pegamento biológico y de FXIII obtenidos después de la etapa de liofilización.

15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende una etapa de uItrafiItración de concentración realizada previamente a la etapa de diafiltración o posteriormente a dicha etapa, antes de la liofilización.

16. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende, 5 antes de la etapa a), una etapa inicial de prepurificación de la fracción plasmática solubilizada mediante un

tratamiento con hidróxido de aluminio y/o una precipitación a baja temperatura.

17. Concentrado liofilizado de fibrinógeno, susceptible de obtenerse mediante la realización del procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende la mezcla de los componentes del tampón de diafiltración definido en la reivindicación 8.

18. Concentrado liofilizado de cola biológica, susceptible de obtenerse mediante la realización del procedimiento de

acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende la mezcla de los componentes del tampón de diafiltración definido en la reivindicación 8.

19. Concentrado liofilizado de Factor XIII, susceptible de obtenerse mediante la realización del procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende la mezcla de los

componentes del tampón de diafiltración definido en la reivindicación 8.

20. Concentrado liofilizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, de calidad terapéutica, obtenido mediante la realización del procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 14.