Secuencias de nucleótidos para el gen TAL.

Un polinucleótido de la bacteria coryneform que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa,

dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre: (a) el polinucleótido, que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica en una extensión de al menos el 90% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2, (b) el polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a).

Secuencias de nucleótidos para el gen TAL

La invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican para el gen tal y un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, usando bacterias coryneform en las cuales el gen tal es amplificado.

Arte anterior

Los amino ácidos, en particular la L-lisina, son usados en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en particular en la nutrición animal.

Es conocido que los amino ácidos son preparados por fermentación a partir de cepas de bacterias coryneform, en particular la Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, el trabajo es constantemente retomado para mejorar el proceso de preparación. Las mejoras al proceso pueden relacionarse con las medidas de fermentación, tales como por ejemplo la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tal como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o el trabajo hasta la conformación del producto por ejemplo por cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Métodos de mutagénesls, selección y selección de mutante son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los antimetabolitos, tales como por ejemplo, el análogo a la lisina S-(2-amlnoetll)-c¡steína, o que son auxotróficas para los metabolltos de Importancia regulatoria y producen L- amino ácidos, tales como por ejemplo L-lisina, son obtenidas de esta forma.

Los métodos de la técnica de ADN recombinante han sido también empleados durante algunos años para mejorar la clase de las cepas Corynebacterium que producen amino ácidos, amplificando los genes de biosíntesis de amino ácidos individuales e investigando el efecto sobre la producción de amino ácidos.

Artículos para revisión en este contexto son encontrados, entre otros, en Kinoshita ("Bacteria de ácido glutámico", en Biology of Industrial Microorganismo, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 4-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-13 (1995)) y Sahm y otros (Annuals of the New York Academy of Sciece 782, 25-39 (1996)).

La Importancia del ciclo de la fosfato pentosa para la biosíntesis y la producción de amino ácidos, en particular la L- llslna, por la bacteria coryneform es el tema de numerosos esfuerzos entre los expertos.

Así Olshl y Alda (Agricultural and Biological Chemistry 29, 83-89 (1965)) reportan sobre la "derivación de la hexosa monofosfato" de la Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto y Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51, 11-18 (1987)) reportan sobre la regulación de la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa en la Brevibacterium flavum.

Objeto de la invención

Los inventores tuvieron el objetivo de proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa de la L- lisina, L-treonina, L-isoleucina.

Descripción de la invención

Los amino ácidos, en particular la L-lisina, son usados en medicina humana, en la industria farmacéutica y en particular en la nutrición animal. Por lo tanto existe un interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación de amino ácidos, en particular la L-lisina.

Cuando la L-lisina o lisina son mencionados en lo adelante, no sólo la base sino también las sales, tales como por ejemplo el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina, son también incluidos.

La invención proporciona un polinucleótido a partir de bacterias coryneform que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre:

(a) el polinucleótido, el cual codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácido que es idéntica a la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO. 2,

(b) el polinucléotico el cual es complementario al polinucleótido de (a).

La invención también proporciona el polinucleótido, siendo este preferentemente un ADN el cual es capaz de replicación, que comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos escogida del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO.3, o

(ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro del rango de la degeneración del código genético, o

La invención también proporciona

un polinucleótido que comprende una de las secuencias de nucleótidos como las mostradas en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3,

un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de amino ácidos como la mostrada en SEQ ID NO. 2.

La Invención también proporciona polinucleótidos que comprenden sustanclalmente una secuencia de pollnucleótldos, los cuales son obtenidos mediante la selección por medio de la hibridación de una biblioteca del gen correspondiente, la cual comprende el gen completo con la secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado, de acuerdo a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3 o un fragmento de la misma, y aislamiento de la secuencia de ADN mencionada.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo a la invención son apropiadas como sondas de hibridación para el ARN, cADN y ADN, con vistas a aislar, en toda la longitud, el cADN que codifica para la transaldolasa y aislar aquellos cADN o genes que tienen una alta similitud de secuencia con aquella del gen de la transaldolasa.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo a la invención son además apropiadas como cebadores para la preparación de ADN de genes que codifican para la transaldolasa mediante la reacción en cadena de la pollmerasa (PCR).

Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden al menos 3, preferiblemente al menos 2, especialmente de manera preferible al menos 15 nucleótidos sucesivos. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 4 o 5 nucleótidos son también apropiados.

"Aislado" significa separado de su medio natural.

"Polinucleótido" en general se refiere a polirribonucleótidos y polldeoxlrrlbonucleótidos, siendo posible que estos sean ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado.

"Polipéptidos" es entendido como péptidos o proteínas que comprenden dos o más amlno ácidos enlazados por medio de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos de acuerdo a la invención incluyen un polipéptido con la actividad biológica de la transaldolasa, que son idénticos al polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO. 2.

La invención además proporciona un proceso para la preparación de amino ácidos, en particular que comprende los siguientes pasos:

a) fermentación de una bacteria coryneform que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular incrementada es lograda por la sobre expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado entre:

a1) el polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica en una extensión de al menos el 9% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2, en un medio para de este modo producir dicho L-amino ácido

b) acumulación de dicho L-amino ácido en el medio o en las células de dicha bacteria

c) aislamiento de dicho L-amino ácido, donde dichos L-amino ácidos se escogen del grupo que consiste en L-lisina, L- treonina o L-isoleucina.

El proceso utiliza bacterias coryneform las cuales en particular ya producen un amino ácido.

El término "amplificación" en este contexto describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de copias del gen o de los genes, usando un promotor potente o usando un gen que codifica para una enzima correspondiente que tiene una alta actividad, y opcionalmente combinando estas medidas.

La invención también proporciona una bacteria coryneform recombinante que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular incrementada es lograda por la sobre expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, donde dicho polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID:2.

Las bacterias coryneform que proporcionan la presente invención...

1. Un polinucleótido de la bacteria coryneform que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre:

(a) el polinucleótido, que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2,

(b) el polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a).

2. Un polinucleótido de la reivindicación 1, la secuencia de nucleótido como la mostrada en SEQ ID NO: 3.

3. Un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el polinucleótido es un ARN.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, dicho polinucleótido siendo seleccionado entre:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3,

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1,

(c) un fragmento de SEQ ID NO: 1,

(d) una secuencia de nucleótidos que corresponden con la secuencia degeneración del código genético, y

5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Corynebacterium glutamicum.

6. El polinucleótido de la reivindicación 2, que codifica un polipéptido que tiene actividad transaldolasa y el cual está contenido en el plásmido pSUZ1, depositado en la cepa DSM 5715 bajo el número DSM 13263.

7. Un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad enzimática de la transaldolasa.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, donde dicho polipéptido tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2 incluyendo intercambios de amino ácidos conservativos seleccionados del grupo que consiste en el intercambio de glicina por alanina o intercambio de ácido aspártico por ácido glutámico.

9. El vector recombinante, donde dicho vector es pSUZ1 depositado en la cepa 5715 bajo el número DSM 13263.

1. Una bacteria coryneform transformada con el vector de la reivindicación 9.

11. Una bacteria coryneform recombinante que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular incrementada es lograda por la sobre expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, donde dicho polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID:2.

12. Un proceso para la preparación de L-amino ácidos, el cual comprende los siguientes pasos:

a) fermentación de una bacteria coryneform que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular incrementada es lograda por la sobre expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado entre:

a1) el polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica en una extensión de al menos el 9% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2, en un medio para de este modo producir dicho L-amino ácido

b) acumulación de dicho L-amino ácido en el medio o en las células de dicha bacteria

c) aislamiento de dicho L-amino ácido, donde dichos L-amino ácidos se escogen del grupo que consiste en L- lisina, L-treonina o L-isoleucina.

13. El proceso de la reivindicación 12, donde dicho L-amino ácido es L-lisina, y donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a) el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa,

b) el gen lysC que codifica para una aspartato cinasa resistente a la regeneración,

(a) a (c) dentro del rango de la dicha bacteria coryneform es

c) el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,

d) el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,

e) el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,

f) el gen tkt que codifica para la transcetolasa,

g) el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato dehidrogenasa,

h) el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,

i) el gen lysE que codifica para una proteína para la exportación de lisina,

j) el gen eno que codifica para la enolasa,

es o son sobre expresados al mismo tiempo.

14. El proceso de la reivindicación 12, donde dicho L-amino ácido es L-treonina, y donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a) el gen hom que codifica para la homoserina dehidrogenasa del alelo homdr que codifica para una homoserina dehidrogenasa "resistente a la regeneración",

b) el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,

c) el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,

d) el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,

e) el gen tkt que codifica para la transcetolasa,

f) el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato dehidrogenasa,

g) el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,

h) el gen thrE que codifica para una proteína para la exportación de treonina,

i) el gen eno que codifica para la enolasa,

es o son sobre expresados al mismo tiempo.

15. El proceso de la reivindicación 12 en el que uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a) el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxicinasa

b) el gen pgl que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa

c) el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa es o son atenuados al mismo tiempo.