Rotavirus aviar de grupo D.

Un ácido nucleico que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico con al menos 90% de identidad con la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de ácido nucleico con al menos 90% de identidad con el complemento inverso de la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

(c) un fragmento de la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en las SEQ ID NOS: 1 y/o 2 que consiste en al menos 24 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOS: 1 y/o 2;

(d) un fragmento del complemento inverso de las secuencias de ácido nucleico como las enumeradas en SEQ ID NOS: 1 y/o 2 que consisten al menos en 16 nucleótidos consecutivos del complemento inverso SEQ ID NOS: 1 y/o 2; o

(e) una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones de rigurosidad alta con una secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Campo técnico Técnica anterior

Los rotavirus pertenecen a la familia de virus Reoviridae, y pueden afectar al sistema gastrointestinal y al tracto respiratorio de pájaros, entre otros organismos. La familia de Reoviridae consiste en diferentes géneros que incluyen orthoreovirus (reovirus de aves y mamíferos) , orbivirus (virus de lengua azul) y rotavirus (grupos A a G) .

Los rotavirus son virus de ARN no envuelto y con doble armazón. El genoma está compuesto por 11 segmentos de ARN de doble hélice, que codifica seis proteínas estructurales y seis proteínas no estructurales. Hay seis proteínas virales (VPs) que forma el cápside de proteína icosaédrico de tres capas del virión. Estas proteínas estructurales se llaman VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7 [1]. VP6 forma la mayor parte de la cápside. Es muy antigénica y puede usarse para identificar especies de rotavirus [2]. Además de las VPs, hay seis proteínas no estructurales (NSPs) que solamente se producen en células infectadas por rotavirus. Se llaman NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 y NSP6 [1].

Los rotavirus aviares (RVAs) son bien conocidos [3, 4 y 5] y con frecuencia afectan a las bandadas de aves, y en particular bandadas de pollos, en todo el mundo. Los síntomas en los pollos infectados son diarrea con posterior aumento lento de peso, un síndrome que se conoce como síndrome de malabsorción (SMA) o síndrome de restricción del crecimiento (SRC) .

En un estudio de campo, se examinaron pollos para consumo de entre 6 y 8 semanas de edad de 8 bandadas con SRC para determinar qué RVAs era los mayores contribuyentes a la patogénesis de SRC [6]. En este estudio, se detectaron RVAs en 32 de 34 pollos de las bandadas con SRC. Se identificaron cuatro grupos de RVAs en bandadas con SRC: RVA A, D, F y G. Los resultados de este estudio mostraron que el grupo de RVA D juega un papel principal en la patogénesis de SRC.

El impacto económico de SRC en los criaderos de pollos es severo. Todos los pollos infectados se perderán. Por lo tanto, la detección temprana y prevención de la infección por RVA es muy deseable.

En la actualidad, RVAs normalmente se detectan e identifican en base a la migración de los 11 fragmentos genómicos de ARN usando ARN-PAGE. La característica del patrón ARN-PAGE de un RVA grupo D es 5:2:2:2 [7]. Este patrón característico de migración de ARN puede usarse para identificar RVAs grupo D.

RVAs también pueden detectarse usando ELISA [8], microscopio electrónico de transmisión y reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) [6]. Solamente PAGE permite la discriminación de diferentes grupos de RVA, pero tiene solamente un grado bajo de sensibilidad. En el presente, los métodos PCR están solamente disponibles para la detección de rotavirus grupo A. En la fecha de prioridad no existían datos de secuencia de nucleótidos para RVAs de grupo D. Por lo tanto, hay una necesidad apremiante de desarrollar métodos alternativos para la detección de otros rotavirus, y en particular rotavirus grupo D. En particular, hay una necesidad apremiante de desarrollar un método de detección rápido y sensible para RVA grupo D.

Divulgación de la invención La presente invención se refiere a la identificación de un nuevo rotavirus aviar grupo D (RVAD) [9] y ofrece varias oportunidades en los campos de veterinaria y farmacia. La invención proporciona:

- La secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido VP6, y fragmentos y variantes del mismo, y ácidos nucleicos complementarios con el ácido nucleico que codifica el polipéptido VP6. -La secuencia de polipéptido VP6 codificado por los ácidos nucleicos mencionados anteriormente, y fragmentos, variantes y fragmentos antigénicos de los mismos. -Las moléculas de ácido nucleico que se hibridizan bajo rigurosidad alta con el ácido nucleico que codifica el polipéptido VP6, incluyendo cebadores y sondas. -Anticuerpos que se unen con el polipéptido VP6, fragmentos, variantes y/o determinantes antigénicos del mismo. -Reactivos diagnósticos y kits que comprenden reactivos para identificar la presencia o ausencia de un RVAD en una muestra biológica y métodos que pueden usarse para diagnosticar infección de RVAD o identificar la presencia

o ausencia de un virus RVAD en una muestra biológica. -Vacunas para el tratamiento de o protección de infección de RVAD. -Métodos para identificar que los huevos, en particular huevos con embrión para la producción de vacuna, están libres de RVAD.

Ã?cido nucleico

La invención proporciona ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos i% identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El valor de i puede seleccionarse de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99, 5%, 99, 9%. La identidad secuencial debería calcularse junto con la longitud completa de la secuencia de nucleótido.

SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia codificadora RVAD VP6 completa. SEQ ID NO: 1 proporciona un ácido nucleico que comprende un fragmento de la secuencia codificadora VP6 como la enumerada en la SEQ ID NO: 2, y además comprende una secuencia no trasladada 3’.

Preferentemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido RVAD VP6. Los ácidos nucleicos de la invención pueden codificar un polipéptido RVAD VP6 como el enumerado en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO. 4.

La invención también abarca fragmentos de las secuencias de ácido nucleico como las enumeradas en SEQ ID NO: 1 y/o 2. De este modo la invención proporciona un ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos n nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOs: 1 y/o 2 donde n es 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50 o más. El ácido nucleico puede tener una longitud total de n+x nucleótidos, donde x= 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50 o más. En una realización, el valor de n es 24.

En una realización adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende el complemento inverso de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99, 5%, 99, 9% idéntica o mayor con el complemento inverso de la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende un fragmento que consiste en al menos n nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOs: 1 y/o 2 donde n es 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50 o más. El ácido nucleico puede tener una longitud total de n+x nucleótidos, donde x= 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50 o más. En una realización, el valor de n es 10.

En una realización adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Condiciones rigurosas ejemplares para hibridización son 0, 1xSSC, 0, 1% SDS a 65 º C durante 10 minutos, y lavar con 2xSSC, 0, 1% SDS durante 10 minutos seguido de 0, 1xSSC, 0, 1% SDS durante 10 minutos más.

La invención proporciona ácido nucleico de la fórmula 5’-X-Y-Z-3’, donde: -X-es una secuencia de nucleótido consistente en x nucleótidos; -Z-es una secuencia de nucleótido consistente en z nucleótidos; -Y-es una secuencia de nucleótido consistente en (a) un fragmento de SEQ ID NO: 1 o 2 o (b) el complemento de (a) ; y dicho ácido nucleico 5’-X-Y-Z-3’ no es (i) un fragmento de SEQ ID NO: 1 o 2 Ni (ii) el complemento de (i) . Las fracciones –X-y/o –Z-pueden comprender, por ejemplo, una secuencia promotora (o su complemento) .

La invención también proporciona ácidos nucleicos que comprenden los ácidos nucleicos y fragmentos de la invención y que pueden comprender más nucleótidos, nucleótidos modificados o una o más etiquetas detectables. Tales ácidos nucleicos pueden ser útiles como cebadores y/o sondas en métodos que incluyen LCR, PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real, RT-PCR en tiempo real, pPCR, pRT-PCR, transferencia Northern y transferencia Southern.

Etiquetas ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, emparejamientos con pares bases, estructuras horquilla y similares. Muchos fluoróforos adecuados son conocidos y pueden usarse, incluidos aunque sin limitar a fluoresceína, en particular 5-FAM (también llamada 5-carboxifluoresceína;... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico con al menos 90% de identidad con la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de ácido nucleico con al menos 90% de identidad con el complemento inverso de la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

(c) un fragmento de la secuencia de ácido nucleico como la enumerada en las SEQ ID NOS: 1 y/o 2 que consiste en al menos 24 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOS: 1 y/o 2;

(d) un fragmento del complemento inverso de las secuencias de ácido nucleico como las enumeradas en SEQ ID NOS: 1 y/o 2 que consisten al menos en 16 nucleótidos consecutivos del complemento inverso SEQ ID NOS: 1 y/o 2; o

(e) una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones de rigurosidad alta con una secuencia de ácido nucleico como la enumerada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

2. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una etiqueta detectable.

3. Un kit que comprende cebadores para amplificar una secuencia plantilla contenida en un ácido nucleico de virus RVAD de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el kit un primer cebador y un segundo cebador, donde el primer cebador comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una parte de dicha secuencia plantilla y el segundo cebador comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una parte del complemento de dicha secuencia plantilla, donde las secuencias en dichos cebadores que tienen sustancial complementariedad definen las terminales de la secuencia plantilla que se amplificará.

4. Un kit de acuerdo con la reivindicación 3, que además comprende una secuencia sonda sustancialmente complementaria a una parte de dicha secuencia plantilla o sustancialmente complementaria a una parte del complemento inverso de dicha secuencia plantilla.

5. Un kit de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, donde la secuencia plantilla está contenida en una secuencia de ácido nucleico como la enumerada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

6. Un método para diagnosticar infección de RVAD o para identificar la presencia o ausencia de un virus RVAD en una muestra biológica, que comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Un polipéptido que comprende:

(a) una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácido como la enumerada en la SEQ ID NO: 3;

(b) una secuencia de aminoácido con al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácido como la enumerada en la SEQ ID NO: 4; o

(c) un fragmento de la secuencia aminoácido como la enumerada en la SEQ ID NO: 3 que consiste en al menos 9 aminoácidos consecutivos derivados de SEQ ID NO: 3; o

(d) un fragmento de la secuencia aminoácido como la enumerada en la SEQ ID NO: 4 que consiste en al menos 15 aminoácidos consecutivos derivados de SEQ ID NO: 4.

8. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. El anticuerpo de la reivindicación 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo aviar.

11. Un inmunoensayo para detectar la presencia o ausencia de un antígeno RVAD en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con el anticuerpo de una cualquiera de la reivindicaciones 8 a

10.

12. El método de la reivindicación 6 o el inmunoensayo de la reivindicación 11, donde la muestra biológica es un huevo.

13. Una vacuna que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una protección contra RVAD.